Распознавание CD-маркеров цитокин-индуцированных клеток киллеров человека методом проточной цитометрии

Цитокин-индуцированные киллеры, CIK, представляют собой гетерогенные иммунные клеточные популяции, полученные ex vivo из культур мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), стимулированных специфическими цитокинами и моноклональными антителами. Клетки CIK включают в себя клеточные популяции, в том числе CD3+CD56+ NK-T-клетки, CD3+CD56-T-клетки и CD3-CD56+ NK-клетки.

Чтобы определить долю клеток CIK, начните с пробирок, содержащих суспензию клеток CIK, полученную из PBMC. Добавить анти-CD3 и анти-CD56 антитела, конъюгированные с различными флуорофорами, и их смесь в назначенные пробирки. Добавьте контролируемые антитела изотипа, конъюгированные с аналогичными флуорофорами в качестве специфических антител, в другие пробирки.

Флуоресцентно меченные анти-CD3 и анти-CD56 антитела распознают и связываются с CD3 и CD56, экспрессируемыми в популяциях клеток CIK соответственно. Антитела контроля изотипа не обладают специфичностью целевого антигена, что облегчает измерение неспецифических фоновых сигналов.

Пипетируйте клетки в пробирки с круглым дном и крышками для клеточных фильтров, которые помогают удалять клеточные агрегаты. Загрузите пробирки в карусель проточного цитометра. Во время пробега каждая клетка проходит через канал и сталкивается с лазерными лучами, рассеивающими свет.

Один детектор измеряет интенсивность прямого рассеянного света, указывающую на размер клетки; другой измеряет интенсивность бокового рассеянного света, перпендикулярную лазерному лучу, что указывает на зернистость клетки. В совокупности эта информация помогает идентифицировать популяцию иммунных клеток.

Одновременно лазерные лучи с определенными длинами волн возбуждения возбуждают флуорофор-конъюгированные антитела на клетках, вызывая излучение флуоресцентных сигналов, которые детектируются.

Анализ удельных интенсивностей флуоресценции на клетках определяет долю субпопуляций клеток ЦИК.

Начните эту процедуру с подготовки клеток ЦИК, как описано в текстовом протоколе. Затем промойте клетки ЦИК 10 миллилитрами стерильного ПБС. Центрифугируйте в течение 10 минут при 300-кратном перегрузке и температуре от 18 до 20 градусов Цельсия. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки с помощью 5 миллилитров PBS. Подсчитайте количество клеток и проверьте жизнеспособность клеток с помощью теста исключения трипанового синего.

Распределите клетки CIK в шесть стерильных 1,5-миллилитровых пробирок с плотностью примерно от 0,5 до 1 миллиона клеток на миллилитр PBS. Пометьте и обработайте клетки, как указано в текстовом протоколе. Осторожно смешайте клетки CIK с антителами, осторожно пипетируя вверх и вниз не менее трех раз стерильной пипеткой объемом 1 миллилитров. Инкубируйте клетки в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте.

Центрифугируйте пробирки в течение 10 минут при 300-кратном g и температуре от 18 до 20 градусов Цельсия. После центрифугирования аспирируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу 1 миллилитром PBS. Затем аккуратно пипетируйте клетки вверх и вниз не менее трех раз стерильной пипеткой объемом 1 миллилитров. Перенесите клеточную суспензию в стерильную 5-миллилитровую полистирольную трубку с круглым дном с крышкой-фильтром, аккуратно проведя пипетированием через колпачок. Затем расположите трубки на карусели по порядку.

Откройте программу для анализа проточной цитометрии и создайте папку для экспериментов. Затем нажмите кнопку «Новый образец», чтобы добавить образец и пробирку в эксперимент. Назовите трубки так, как указано в текстовом протоколе.

Чтобы создать систему дифференциации для популяций клеток CIK, сначала выберите пробирку 1 и нажмите кнопку Точечная диаграмма, чтобы создать график FSC-A/SSC-A. Нарисуйте прямоугольный затвор над всей популяцией клеток с пороговым значением FSC-A больше 5000, чтобы исключить клеточный мусор.

Выберите параметр FSC-A/FSC-H для новой точечной диаграммы и нарисуйте многоугольный вентиль вокруг всех отдельных ячеек. Выберите параметр count versus FITC-conjugated (CD3) и count versus APC-conjugated (CD56) для нового графика гистограммы. Выберите параметр FITC-сопряженный (CD3) и APC-сопряженный (CD56) для новой точечной диаграммы и нарисуйте четырехквадрантный вентиль для определения четырех субпопуляций.

Запишите данные из 20 000 отдельных клеток в каждом образце. Нажмите кнопку "Загрузить образец", чтобы сначала проанализировать пустой контрольный образец. Идентификация всей популяции клеток CIK с помощью параметров каналов CD56 и CD3. Откройте файлы, содержащие статистические значения отдельного образца, чтобы проанализировать популяции клеток CIK и повторно распечатать их в файлах анализа.