Анализ на выявление секреции интерферона-гамма в лимфоидных органах мышей

Интерферон-гамма, или ИФН-γ, цитокин, секретируемый Т-клетками лимфоцитов и естественными клетками-киллерами или NK-клетками, опосредует иммунный ответ против патогенов.

Чтобы изучить in situ продукцию ИФН-γ, возьмем мышь, которой пересадили флуоресцентно меченые Т-клетки, сконструированные для экспрессии рецептора, распознающего овальбумин — модельный антиген.

Возьмите суспензию патогенных бактерий — генетически модифицированных для экспрессии овальбумина — и введите ее внутривенно мыши, вызвав системную инфекцию. Циркулирующие бактерии достигают селезенки — вторичного лимфоидного органа, который способствует удалению патогенов, облегчая взаимодействие с иммунными клетками.

Антигенпрезентирующие клетки поглощают бактерии и отображают антиген. Т-клетки связываются с антигеном через его рецептор, активируются и продуцируют ИФН-γ.

Клетки макрофагов, инфицированные бактериями, высвобождают иммунные медиаторы и активируют лиганды на своей поверхности. При взаимодействии с этими сигналами NK-клетки активируются и вырабатывают ИФН-γ.

Введите ингибитор внутриклеточного транспорта белка для ограничения секреции ИФН-γ, вызывающего его внутриклеточное накопление.

Соберите урожай из селезенки мыши. Зафиксируйте ткань и заморозьте ее, чтобы облегчить секирование. С помощью криомикротома сгенерируйте тонкие срезы ткани и поместите их на предметные стекла. Добавьте специфические антитела к NK-клеткам, которые связываются с поверхностными маркерами, и специфические антитела к ИФН-γ, которые окрашивают внутриклеточный ИФН-γ. Эти антитела помечены разными флуорофорами.

Поместите предметное стекло под флуоресцентный микроскоп, чтобы обнаружить ИФН-γ внутри NK-клеток и Т-клеток.

Выбросьте фиксирующий раствор и добавьте 5 миллилитров PBS на 5 минут при комнатной температуре, при слабом перемешивании. Затем замените PBS 5 миллилитрами 30% сахарозы и инкубируйте от 12 до 24 часов, чтобы сохранить морфологию ткани. Теперь орган опускается на дно пластины.

Чтобы заморозить образец, положите сухой лед в большую емкость и поместите внутрь емкость поменьше, содержащую около 50 миллилитров чистого метанола и несколько кусочков сухого льда. Аккуратно высушите селезенку на безворсовой салфетке. Капните каплю компаунда OCT на дно формы основания и поместите селезенку внутрь формы. Будьте осторожны, чтобы не образовались пузырьки.

Добавьте примерно 1 миллилитр ОКТ на селезенку. С помощью щипцов нанесите форму основания на поверхность метанола в ванну с сухим льдом, следя за тем, чтобы метанол не касался ОКТ. ОКТ загустевает и становится белым при замораживании. Не забывайте замораживать ткань как можно быстрее, чтобы свести к минимуму артефакты.

На крио-микротоме устанавливают температуру минус 21 градус по Цельсию. Разрежьте ткань до желаемой толщины около 10 микрометров. С помощью кисти соберите срезы на предметные стекла стеклянного микроскопа и осмотрите их визуально. Дайте секциям нагреться до комнатной температуры.

Нарисуйте круг блокатором жидкости, например, ПАП-ручкой, вокруг участка ткани за пределами ОКТ. После того, как ткань высохнет, регидратируйте образец, капнув 100 микролитров PBS на участок ткани в течение 5 минут. Затем удалите PBS из среза путем аспирации и добавьте 100 микролитров блокирующего раствора на каждую пробную секцию. Инкубируйте в закрытой влажной камере не менее одного часа при комнатной температуре.

Для окрашивания первичными антителами замените блокирующий раствор на приготовленную смесь первичных антител для каждого образца. Выдерживать в течение четырех часов при комнатной температуре или в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия в закрытой влажной камере, перед промывкой согласно рукописи.

Теперь разведите интересующие вторичные антитела до оптимальной концентрации, обычно 2,5 микрограмма на миллилитр в блокирующем растворе. Удалите окончательный промывочный раствор из секции, добавьте приготовленную смесь вторичных антител поверх секции и инкубируйте в течение одного-четырех часов при комнатной температуре в закрытой влажной камере.

После промывки с буфером для промывки в соответствии с рукописью удалите раствор для промывки и выполните окончательную промывку с помощью PBS. Аспирируйте фосфатно-солевой буфер и дайте оставшемуся PBS испариться без полного высыхания секции.

Нарисуйте круг вокруг секции на обратной стороне предметного стекла. Затем капните каплю монтажного материала поверх образца, убедившись, что среда покрывает весь участок, и осторожно поместите сверху покровное стекло. Дайте образцам полимеризоваться в течение ночи при комнатной температуре в темноте.

Утром поместите предметное стекло под перевернутый спектральный лазерно-сканирующий микроскоп. Установите объективы на 10x/NA 0,40 или 60x/NA 1,4 для анализа субклеточной локализации цитокинов.