Выделение иммунных регуляторных клеток Sertoli из семенных канальцев мышей

Семенные канальцы яичек содержат клетки Сертоли, которые питают половые клетки. Клетки Сертоли соединены плотными соединениями и прочно прикреплены к основанному матриксу, богатому гиалуроновой кислотой. Такое расположение клеток Сертоли регулирует проникновение иммунных клеток в канальцы и защищает развивающиеся половые клетки от деградации.

Чтобы выделить клетки Сертоли, начните с пробирки, содержащей частично переваренные семенные канальцы, полученные из яичек мыши. В этих канальцах отсутствуют перитубулярные клетки — гладкомышечные клетки, окружающие семенные канальцы.

Обработайте канальцы ферментным коктейлем, содержащим гиалуронидазу — необходимую для гидролиза гиалуроновой кислоты — и ДНКазу.

Гиалуронидазы проникают в канальцы и расщепляют гиалуроновую кислоту — базальный полисахарид — инициируя отделение клеток Сертоли от базального матрикса и высвобождая зародышевые клетки в раствор. ДНКаза переваривает любые загрязнения ДНК из раствора, предотвращая агрегацию клеток.

Промойте ферментативно переваренные канальцы буфером, удаляя остатки ферментов, клеточных фрагментов и половых клеток. Переваренные канальцы снова суспензируются и загрузите суспензию в игольчато-шприцевой узел.

Проведите раствор несколько раз, чтобы создать гидродинамический сдвиг и нарушить плотные соединения клеток Сертоли, высвобождая их как отдельные клетки вместе с оставшимися половыми клетками.

Фильтруйте клеточную суспензию, удаляя клеточный мусор и получая одноклеточную суспензию. Центрифугируйте фильтрат для гранулирования ячеек.

Ресуспендируйте клетки в бессывороточной питательной среде для селективной экспансии клеток Сертоли.

Чтобы изолировать клетки Сертоли, используйте новую 25-миллилитровую пипетку, чтобы полностью ресуспендировать осевшие канальцы в 25 миллилитрах PBS. Дав трубочкам отстояться еще 12 минут, с помощью той же пипетки промыть трубочки еще три раза таким же образом. Затем переложите трубочки в новую 100-миллилитровую бутылку с завинчивающейся крышкой и добавьте раствор гиалуронидазы-ДНКазы-I. Далее перевариваем трубочки на встряхивающей водяной бане при температуре 32 Цельсия в течение пяти минут.

Проверьте аликвоту суспензии с помощью светового микроскопа при 100-кратном увеличении. Должны быть видны короткие канальцы, трубчатые агрегаты и высвободившиеся клетки. Дайте трубчатым агрегатам отстояться в течение 10 минут. Затем используйте новую 25-миллилитровую пипетку, чтобы удалить надосадочную жидкость, и промойте агрегаты четыре раза в 25 мл PBS, с 10-минутным осаждением между каждым мытьем.

Популяция загрязняющих PTC будет уменьшена. После последнего промывания добавьте в ячейки 20 мл среды RPMI 1640 и пропустите суспензию через иглу 18G, установленную на 20-миллилитровом шприце 10 раз. Затем быстро убедитесь, что все агрегаты были диссоциированы, и отфильтруйте клеточную суспензию через клеточный фильтр толщиной 70 микрон, чтобы получить чистую одноклеточную суспензию.

Уменьшите содержание фильтрата, используя 25-миллилитровую пипетку, чтобы осторожно отсасывать надосадочную жидкость. Затем ресуспендируйте изолированные клетки Сертоли в 40 мл бессывороточной среды RPMI 1640. Затем подсчитайте количество жизнеспособных клеток методом исключения трипан-синего и отрегулируйте концентрацию клеток до 3 x 10⁶ клеток на миллилитр. Наконец, скармливайте 1 миллилитр клеток на лунку в шестилуночном планшете.