Селективное выделение CD4^{+ Vδ1+} γδ Т-клеток из мононуклеарных клеток периферической крови человека

γδ Т-клетки экспрессируют Т-клеточные рецепторы, TCR, состоящие из гамма- и дельта-цепей с вариабельными и постоянными доменами.

CD4+ Vδ1+ Т-клетки — субпопуляция γδ Т-клеток — совместно экспрессируют вариабельную цепь Vδ1 и корецептор CD4. Эти клетки мигрируют в воспаленные ткани и трансдифференцируются в функционально зрелые CD4+ или CD8+ αβ Т-клетки, опосредуя иммунный ответ.

Для выделения CD4+ Vδ1+ Т-клеток из мононуклеарных клеток периферической крови человека, PBMC, ресуспендируют клетки в буфере. Используйте Fc-блокирующий реагент для блокирования Fc-рецепторов на клеточной поверхности и предотвращения связывания неспецифических антител.

Добавьте анти-Vδ1 антитела, конъюгированные с флуорофором FITC, которые связываются с Vδ1-антигенами γδ Т-клеток. Инкубируют с магнитными микрогранулами, связанными с антителами против FITC, которые прикрепляются к красителю FITC на антителах, связанных с Vδ1 Т-клетками.

Пропустите смесь через магнитную колонку для привлечения связанных с шариками Vδ1+ Т-клеток; Vδ1-Т-клетки останутся несвязанными и впоследствии вымываются наружу. С усилием промывайте колонку, проталкивая через нее буфер, чтобы отделить Vδ1+ Т-клетки.

Инкубируйте клетки с магнитными шариками, покрытыми анти-CD4-антителами, которые связываются с корецептором CD4 клеток. Поместите трубку в магнит, чтобы притянуть связанные с шариками CD4+ Vδ1+ Т-клетки; CD4-Vδ1+ Т-клетки остаются несвязанными.

Ресуспендируйте CD4+ Vδ1+ Т-клетки в среде. Добавьте реагент для отделения шариков, чтобы высвободить шарики из клеток. Установите трубку на магнит, чтобы отделить бусины.

Соберите супернатант клеток CD4+ Vδ1+ для дальнейшего анализа.

Перед началом выделения Vδ1 Т-клеток используйте аликвоту PBMC 1 x 10⁶ для оценки частоты Vδ1CD4-положительных Т-клеток в донорском образце с помощью проточной цитометрии. Затем раскрутите остальные лимфоциты и повторно суспендируйте гранулу в 60 микролитрах буфера MACS на 1 x 10⁷ клеток.

Затем блокируют клетки в 20 микролитрах Fc-блокирующего реагента на 1 х 10⁷ клеток с последующим добавлением 10 микролитров конъюгированного с FITC античеловеческого антитела Vδ1 на 1 х 10⁷ клеток в течение 12 минут при 4 градусах Цельсия в темноте. По окончании инкубации промойте клетки в 14 миллилитрах буфера MACS.

Ресуспендировать гранулу в 80 микролитрах буфера MACS на 1 х 10⁷ клеток, и добавить 20 микролитров микрогранул анти-FITC на 1 х 10⁷ клеток при перемешивании. Через 15 минут в темноте при температуре 4 градуса Цельсия промойте клетки в 10 миллилитрах свежего буфера MACS.

Во время центрифугирования уравновесьте предварительно охлажденную магнитную колонку с 500 микролитрами буфера MACS. Затем повторно суспендируйте ячейки в 500 микролитрах буфера MACS и осторожно добавьте их в верхнюю часть столбца.

Промойте колонку тремя 500-микролитровыми буферными смывками MACS. Затем снимите колонку с магнита и с помощью поршня быстро промойте Vδ1-положительные клетки с 1 миллилитром буфера MACS в 15-миллилитровую коническую трубку.

Пропустив клетки через вторую колонку, внесите 25 микролитров гранул CD4 в течение 30 секунд. Затем переложите шарики в реакционную пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую 1 миллилитр буфера MACS, и поместите пробирку на магнит.

Через 1 минуту с помощью пипетки объемом 200 микролитров осторожно отасуньте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте шарики в 25 микролитрах буфера MACS. Затем раскрутите выделенные Vδ1-положительные клетки и повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах буфера MACS. Энергично перемешайте ячейки с бусинами. Затем, через 20 минут при температуре 4 градуса Цельсия, при постоянном наклоне, поместите трубку обратно на магнит.

Чтобы избежать потери объема образца и свести к минимуму присутствие загрязняющих CD4-отрицательных клеток, важно дозировать любой оставшийся буфер с внутренней стороны крышки обратно во флакон.

Через две минуты с помощью пипетки объемом 200 микролитров перенесите CD4-отрицательный Vδ1-положительный клеточный надосадочный слой в свежую пробирку. Затем извлеките CD4-положительные клетки из магнита и снова суспендируйте их в 500 микролитрах буфера MACS.

После удаления CD4-отрицательных клеток еще два раза, как только что продемонстрировано, инкубируйте CD4-положительные клетки в 100 микролитрах питательной среды и 10 микролитрах раствора для отделения гранул при комнатной температуре в течение 45 минут при постоянном наклоне. В конце инкубации верните клетки в магнит на 1 минуту и с помощью пипетки объемом 200 микролитров перенесите Vδ1-положительный CD4-положительный клеточный надосадочный слой без гранул в новую пробирку.

После удаления оставшихся бусин еще два раза, как только что показано, поверните ячейки вниз. Затем ресуспендируйте Vδ1-положительные CD4-положительные клетки в свежей, предварительно подогретой среде для подсчета.