Энциклопедия экспериментов JoVE
Иммунология
0 просмотров • 3:19 мин. • July 8th, 2025
Десна, или ткань десен, окружает шейную часть зубов и челюстную кость.
Деснневая ткань состоит из слоя эпителия, отделенного от нижележащей соединительной ткани базальной мембраной, богатой коллагеном IV. Соединительная ткань десны содержит иммунную клеточную сеть, включая лимфоциты, тучные клетки и нейтрофилы, которые защищают десну от инфекций.
Чтобы изолировать иммунную клеточную сеть десны, возьмите блоки мышиных зубов, содержащие прочно прикрепленную десневую ткань. Обработайте блоки ферментным коктейлем, содержащим коллагеназы и ДНКазы четвертого типа.
Коллагеназы проникают в ткани, разрушают коллаген-IV и разрушают базальную мембрану и десневой эпителий, в результате чего десна отслаивается от зубов. Между тем, ДНКазы разрушают загрязнители ДНК. Добавьте в пробирку хелатирующий агент; для удаления двухвалентных катионов и предотвращения агрегации клеток.
Перенесите переваренные зубные блоки в чашку Петри, содержащую среду ДНКазы. Извлеките ткань десны из зубных блоков и перенесите ее в клеточное ситечко.
С помощью поршня разомните ткань. Эта механическая диссоциация разрушает соединительный слой десны, высвобождая иммунные клетки из ткани. Промойте ситечко с помощью фильтрата и соберите высвободившиеся ячейки в фильтрат.
Центрифугируйте фильтрат, гранулируя клетки, и выбросьте надосадочную жидкость, содержащую остаточные ферменты и мусор. Ресуспендируйте популяцию клеток, несущих иммунные клетки, в полной среде, готовой к будущему анализу.
Удалите лишнюю ткань с границы десны и перенесите верхнечелюстную и нижнечелюстную блоки в 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую 5 миллилитров коллагеназы и ДНКазы на льду. Переваривайте ткань в шейкере-инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение 1 часа, добавляя 50 микролитров 0,5 молярной ЭДТА в течение последних пяти минут. Затем добавьте к тканям 5 миллилитров холодной ДНКазной среды и аккуратно перемешайте содержимое тюбика, перемешивая его. Затем перенесите четыре блока ткани в чашку Петри и накройте их 500 микролитрами свежей среды ДНКазы.
С помощью скальпеля удалите десну из каждого блока ткани и перенесите все содержимое чашки в 70-микронный клеточный фильтр на 50-миллилитровой трубке. Промойте чашку Петри и ситечко от 3 до 5 миллилитров свежей среды ДНКазы, а затем с помощью поршня стерильного 3-миллилитрового шприца разомните десневые ткани о сетку ситечка. Промойте сетчатое фильтр от 30 до 35 миллилитров холодной среды ДНКазы и центрифугируйте фильтрат. Затем повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре полной среды, и определите количество жизнеспособных клеток.