$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Внеклеточные ловушки макрофагов (MET) представляют собой паутинистые структуры, выделяемые макрофагами для улавливания и уничтожения патогенов.
МЕТ содержат внеклеточные хроматиновые волокна, связанные с матриксной металлопротеиназой-9, ММП-9 и цитруллинированным гистоном H3, H3Cit — модифицированным белком гистона, в котором аргинин превращается в цитруллин.
Чтобы охарактеризовать МЕТ в фиксированных формалином и залитых парафином срезах легочной ткани мышей, во-первых, высушите предметные стекла. Погрузите в ксилол для депарафинизации срезов. Используйте водный этанол для регидратации секций.
Нагрейте срезы, чтобы разорвать индуцированные формалином белковые сшивки, обнажая целевые антигены для последующего связывания антител.
Добавьте раствор, содержащий белок, чтобы блокировать неспецифические сайты связывания. Инкубируйте с коктейлем первичных антител против MMP-9, против H3Cit и против F4/80.
Антитело против F4/80 связывается с поверхностным гликопротеином F4/80 макрофагальной клетки. Антитела против MMP-9 и H3Cit связываются с MMP-9 и H3Cit в МЕТ соответственно. Добавляйте различные флуорофор-конъюгированные вторичные антитела, которые связываются с соответствующими первичными антителами, связанными с их мишенями.
Монтируйте секции с помощью монтажной среды, содержащей DAPI. DAPI окрашивает хроматиновые волокна METs. С помощью конфокального микроскопа визуализируйте срезы, чтобы визуализировать флуоресценцию маркеров MET.
МЕТ характеризуются внеклеточными хроматиновыми волокнами и коэкспрессией F4/80, MMP-9 и H3Cit.
Чтобы предварительно обработать образцы FFPE раствором для извлечения антигена, высушите предметные стекла в духовке при температуре 60 градусов Цельсия в течение 60 минут. Затем перенесите предметные стекла в раствор ксилола на 30 минут, прежде чем перенести образцы на 70% этанол при комнатной температуре на 5 минут.
После использования водопроводной воды для промывки предметных стекол поместите их в термонепроницаемую полиэтиленовую пленку и подвергните их более высокому извлечению антигенов, поместив их в скороварку с pH 9,0 Tris-EDTA на 10 минут. Остудите образцы в течение 20 минут, и переложите их в водопроводную воду. Затем поместите их на коромысло на 5 минут. Повторите промывку водой из-под крана, а затем промойте слайды один раз в PBS на коромысле.
Чтобы заблокировать образцы, добавьте 10% куриную сыворотку в 5% BSA/PBS и инкубируйте их при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем, чтобы определить внеклеточные ловушки макрофагов, или МЕТ в макрофагах, добавьте разведение первичных антител от 1 до 100 в 1% BSA/PBS и инкубируйте стекла при температуре 4 градуса Цельсия в течение 16 часов.
Используйте PBS, чтобы промыть образцы два раза на коромысле по 5 минут каждый. Добавьте соответствующие флуоресцентные вторичные антитела в 1% BSA/PBS и инкубируйте предметные стекла при комнатной температуре в течение 40 минут. После промывки PBS используйте DAPI-содержащую монтажную среду для окрашивания хроматина и монтажа образцов.
С помощью конфокальной лазерной сканирующей головки, прикрепленной к инвертированному микроскопу, можно получить флуоресцентные изображения с использованием воздушных объективов с концентрацией 20X 0,1 NA и масляной концентрацией 40X 1,0 NA. Захватывайте одноплоскостные изображения размером 512 x 512 пикселей, щелкнув кнопку выравнивания в виде последовательности строк. Получите не менее 10 полей обзора на раздел для анализа и данных для каждого результата.