Прижизненная визуализация гамма-дельта интраэпителиальных лимфоцитов

Гамма-дельта интраэпителиальные лимфоциты, γδ IEL, являются специализированными мигрирующими Т-клетками, экспрессирующими гамма-дельта Т-клеточные рецепторы. Эти клетки преимущественно находятся в эпителии кишечника и патрулируют эпителий, ограничивая транслокацию патогена по кишечнику.

Чтобы визуализировать γδ ИЭЛ в живом организме, начните с трансгенной мыши, находящейся под наркозом, с частично обнаженным тонким кишечником. Трансгенная мышь генетически модифицирована для экспрессии репортерных белков — усиленных зеленых флуоресцентных белков — исключительно в γδ IEL, что позволяет отслеживать их.

С помощью электрокаутерии создайте линию перфорации над обнаженной тонкой кишкой вдоль антиментериальной поверхности, предотвращая чрезмерное кровотечение.

Сделайте продольный разрез над линией перфорации, чтобы обнажить слизистую оболочку кишечника, обнажив множественные пальцеобразные выступы — ворсинки. Каждая ворсинка содержит эпителиальные клетки с проживающими γδ IEL, которые выступают в просвет кишечника.

Расположите мышь так, чтобы открытая поверхность слизистой оболочки находилась непосредственно в контакте с флуоресцентным красителем, придавая просвет красной флуоресценции.

Представьте себе мышь под конфокальным микроскопом. Найдите ворсину и сделайте изображение в разных фокальных плоскостях вдоль оси z, начиная с эпителия на кончике ворсинок. Объедините эти оптические участки для создания 3D-изображения.

Прижизненная визуализация показывает динамическое движение зеленой флуоресценции γδ IEL вдоль базальной мембраны эпителиальной клетки вблизи красного просвета.

Разместив две пары щипцов по обе стороны от подлежащей брыжейки между кровеносными сосудами, осторожно потрите кончики щипцов друг о друга, чтобы создать отверстие в мембране. Используя щипцы под углом и изогнутую иглу с коническим концом, прикрепленную к 5-сантиметровому шву, проникните в одну сторону брюшины через отверстие в мембране и вверх через другую сторону слизистой оболочки брюшины, поместив один шов вверху, а другой в нижней части разреза, чтобы закрыть разрез, сохраняя при этом петлю кишечника экстернализованной.

Чтобы повысить вероятность успеха, не перевязывайте и не разрывайте кровеносные сосуды во время размещения брюшной полости, а также ограничьте любое постороннее обращение с кишечником.

Затем таким же образом закройте кожу под петлей кишечника, наложив один шов в середине разреза между предыдущими швами в подлежащей брюшине. С помощью электрокаутеризации сделайте линию перфорации вдоль противобрыжеечной границы и сразу же нанесите несколько капель воды на поверхность кишечника, чтобы предотвратить дополнительное повреждение тканей, вызванное теплом.

Промокните салфеткой Kimwipe, чтобы удалить остатки воды. С помощью ножниц Vannas разрежьте горизонтальный разрез размером примерно 1,5 сантиметра на дистальном крае прижигаемой ткани, по длине прижигаемой линии по направлению к проксимальному концу сегмента наружной ткани. Когда поверхность слизистой оболочки обнажена, накройте живот влажным Kimwipe, чтобы сохранить ткань увлажненной.

Для конфокальной микроскопии с вращающимся диском транспортируйте мышь к микроскопу в закрытом сосуде. Запустите программное обеспечение для визуализации, наклоните головку микроскопа назад и добавьте 150 микролитров 1 микромолярного красителя AlexaFluor в буферном солевом растворе Хэнка на стеклянное покровное дно. Расположите мышь так, чтобы открытая поверхность слизистой непосредственно соприкасалась с покровным стеклом.

Поместите мышь и чашку на столик для визуализации в предварительно нагретом инкубаторе. Установите интенсивность возбуждения и время экспозиции для каждого лазера не более чем от 10 до 15 милливатт и от 120 до 150 миллисекунд соответственно, а среднее значение кадра установите на «2».

Включите функцию умножения электронов для уменьшения фонового шума и выберите калибровку объектива 63X, чтобы обеспечить правильное измерение размера пикселя. Используя 405-нанометровый лазер и 20-кратный воздушный объектив, вручную визуализируйте ядра, чтобы найти поле ворсинок, в котором отсутствует заметное движение или дрейф, избегая областей артефактного движения из-за дыхания, перистальтики или сердцебиения.

Используя сканирование XY, запишите координату x-y интересующего поля и переключитесь на объектив погружения в глицерин 63X. Получите изображение в реальном времени на 405-нанометровом канале в течение 1 минуты, чтобы убедиться в стабильности ворсинок в выбранном поле, одновременно регулируя фокус так, чтобы найти ортогональную плоскость непосредственно под ворсинчатым кончиком.

Затем получите Z-стеки, начиная чуть ниже эпителия ворсинчатого конца, примерно от 15 до 20 микрометров, вплоть до ворсинок, до тех пор, пока не станет трудно разглядеть ядра с шагом 1,5 микрометра. Через 3-5 минут после начала сбора подтвердите стабильность изображения и гамма-дельта внутриэпителиальную подвижность клеток, и продолжайте получать изображения в течение 30-60 минут для каждого поля ворсинок.