Метод выделения первичных тучных клеток из брюшинной полости мыши
JoVE Encyclopedia of Experiments
Иммунология
0 просмотров • 4:17 мин • July 8th, 2025
Тучные клетки — белые кровяные тельца, содержащие цитоплазматические гранулы, заполненные медиаторами воспаления — играют важную роль во врожденных и адаптивных иммунных реакциях.
Чтобы изолировать тучные клетки соединительнотканного типа из брюшной полости — заполненного жидкостью пространства, в котором находятся органы брюшной полости, — используют усыпленную мышь, зафиксированную в лежачем положении. Сделайте продольный разрез до грудины, обнажив брюшную стенку.
Брюшная полость находится под брюшной стенкой и содержит жидкость, в которой находятся несколько иммунных клеток, включая макрофаги, лимфоциты, полиморфноядерные лейкоциты и тучные клетки.
Чтобы изолировать клетки с помощью перитонеального лаважа — аспирации внутрибрюшинного содержимого — введите ледяную питательную среду в брюшную полость без перфорации органов, избегая утечки крови. Холодная среда помогает поддерживать жизнеспособность клеток.
Осторожно встряхивайте мышь в течение достаточного времени, смешивая иммунные клетки со средой. Введите в полость пустой шприц. Медленно отсасывайте среду, восстанавливая большую часть введенной жидкости для лучшего выхода клеток.
Переложите клеточную суспензию в пробирку для сбора. Центрифуга для осаждения клеток в виде гранул. Выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу в подходящей среде.
Пластинируйте клетки и инкубируйте их при физиологических условиях, позволяя клеткам прилипать к культуральному сосуду. Добавьте специфические цитокины, которые связываются с их рецепторами на тучных клетках, индуцируя пролиферацию клеток.
Пролиферировавшие клетки готовы к последующему анализу.
Чтобы начать эту процедуру, распылите на усыпленную мышь 70% этанола, и закрепите ее на поролоновом блоке тыльной стороной вниз с помощью булавок. С помощью ножниц с тупым краем снимите кожу над брюшной полостью мыши и не повредите брюшную полость.
Затем введите 7 миллилитров ледяной среды RPMI в брюшную полость, осторожно вставив иглу 27-го калибра в брюшину. Не перфорируйте никакие органы и используйте пятно в области придаткового жира, чтобы снизить риск перфорации органа.
После инъекции встряхните мышь в течение 1 минуты, чтобы отсоединить клетки брюшины в среду RPMI. Не встряхивайте мышь слишком сильно, чтобы не повредить внутренние органы и не загрязнить кровью брюшную полость. Затем повторно используйте шприц, оснастив его новой канюлей 20-го калибра.
Сдвиньте внутренние органы в одну сторону, наклонив поролоновый блок и осторожно постучав им по скамье, чтобы облегчить аспирацию среды с другой стороны. Впоследствии введите иглу 20-го калибра, скосите вверх, чтобы отсасывать жидкость из брюшной полости мягко и медленно, чтобы избежать закупорки внутренними органами.
Соберите как можно больше жидкости. Затем извлеките иглу из шприца и перенесите собранную клеточную суспензию в сборную пробирку на лед. Выбросьте пробирку с образцом, если есть видимое загрязнение крови.
Центрифугируйте пробирку с чистой клеточной суспензией при 300 х г в течение 5 минут. Под стерильный капюшон сделайте аспирацию надосадочной жидкости. Повторно суспендируйте гранулы образца в холодной среде PMC и перенесите клеточную суспензию в колбу для клеточных культур площадью 25 квадратных сантиметров.
Затем добавьте факторы роста IL3 и SCF до конечных концентраций 10 нанограмм на миллилитр и 30 нанограмм на миллилитр соответственно. Инкубируйте клетки в течение примерно 48 часов при температуре 37 градусов Цельсия, до следующей процедуры.
Обзор
В данной статье подробно описан метод выделения тучных клеток соединительнотканного типа из брюшной полости эвтаназированных мышей. В процедуре особое внимание уделяется сохранению жизнеспособности клеток и правильным методам работы для предотвращения контаминации.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Клеточная биология
- Экспериментальные методы
Теоретическая часть
- Тучные клетки играют ключевую роль в иммунных реакциях.
- Они содержат гранулы, заполненные медиаторами воспаления.
- Выделение этих клеток важно для различных видов анализа.
- Брюшная полость является богатым источником иммунных клеток.
Цель исследования
- Предоставить детальный протокол выделения мастоцитов.
- Обеспечить высокую жизнеспособность клеток в процессе выделения.
- Облегчить проведение последующих анализов с использованием выделенных мастоцитов.
Используемые методы
- Эвтаназия мыши и подготовка животного к диссекции.
- Введение охлажденной среды для роста в брюшную полость.
- Аспирация содержимого брюшной полости для сбора иммунных клеток.
- Центрифугирование и ресуспендирование клеточного осадка для культивирования.
Основные результаты
- Успешное выделение мастоцитов из брюшной полости.
- Сохранение высокой жизнеспособности клеток на протяжении всей процедуры.
- Возможность культивирования клеток и индукции их пролиферации с помощью цитокинов.
Выводы
- Описанный метод эффективен для выделения мастоцитов.
- Соблюдение правильной техники имеет решающее значение для предотвращения контаминации.
- Выделенные клетки пригодны для дальнейшего экспериментального применения.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Выделение первичных тучных клеток из брюшной полости мышей позволяет изучить механизмы воспалительных путей в исследованиях в области иммунологии и аллергологии. Данный метод способствует валидации мишеней, обеспечивая физиологически релевантный источник тучных клеток соединительнотканного типа для функциональных анализов. Метод облегчает доклиническую оценку рисков при разработке иммуномодулирующих препаратов за счет воспроизводимой подготовки клеток и последующего анализа фенотипических показателей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать воспалительные пути, зависимые от тучных клеток, и степень взаимодействия с мишенью в контексте первичных клеток.
- Практическая ценность: обеспечивает воспроизводимый источник зрелых тучных клеток для разработки анализов и проведения скрининговых каскадов.
- Прогностическая ценность: поддерживает функциональную валидацию иммуномодулирующих мишеней с помощью показателей потока ионов кальция и дегрануляции.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать первичные мастоциты, подходящие для исследований взаимодействия лиганд-рецептор и анализов высвобождения медиаторов.
- Практическая ценность: позволяет получать жизнеспособные клетки, которые могут быть стандартизированы для проведения серии экспериментов с целью обеспечения согласованного фармакологического профилирования.
- Масштабируемость: обеспечивает подготовку партий клеток для скрининга библиотек соединений со средней и высокой пропускной способностью.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Связывает результаты исследований in vitro с биологией мастоцитов при заболеваниях в моделях воспаления и аллергии.
- Практическая ценность: Позволяет характеризовать зависимость «доза-эффект» для биологических препаратов и малых молекул, влияющих на активацию мастоцитов.
- Снижение рисков: Обеспечивает раннее выявление побочных иммуномодулирующих эффектов до начала исследований in vivo.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод изоляции применяется на этапе поисковой биологии, позволяя получить валидированные первичные клетки для исследований по взаимодействию с мишенью перед этапами оптимизации соединений-лидеров и доклинических испытаний эффективности.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез относительно медиаторов тучных клеток и путей рецепторной сигнализации в нативной клеточной среде.
- Скрининг: Предоставляет готовые к анализу клетки с определенной жизнеспособностью и реактивностью для проведения кампаний по скринингу соединений.
- Аналитика: Позволяет проводить количественное измерение потока ионов кальция и дегрануляции в качестве функциональных показателей модуляции мишени.
- Трансляционные исследования: Связывает результаты фундаментальных открытий с доклиническими моделями путем использования первичных тучных клеток, релевантных для конкретного заболевания.
- Корпоративное повторное использование: Устанавливает стандартизированный рабочий процесс подготовки клеток, применимый в различных проектах по иммунологии и воспалению.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает уверенность в выборе мишени за счет функциональной валидации в первичных мастоцитах, экспрессирующих нативные профили рецепторов.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость и снижает вариабельность в анализах на основе мастоцитов в разных группах и центрах.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет раннего выявления иммуномодулирующих рисков на этапе поиска.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию кандидатов с учетом рисков на основе профилей активности в мастоцитах.
Особенности реализации
- Требуется опыт в проведении диссекции мышей и владении методами асептической работы с клетками.
- Необходим доступ к стерильным условиям для культивирования клеток и реагентам-цитокинам (IL-3, SCF).
- Требуется стандартизация объема промывной жидкости, скорости центрифугирования и времени инкубации для всех операторов.
- При переходе к использованию тучных клеток человека или альтернативных моделей тканей необходимо учитывать особенности адаптации метода.
- Ограничено выходом и чистотой клеток, получаемых из брюшной полости мыши, что требует валидации каждой экспериментальной партии.
Чаво биофармацевтики
Оценки воздействия наркотиков на основе антител на мышиных костного мозга и перитонеальных макрофагов активации
Похожие видео
0 Просмотры
Нейтрофильные внеклеточного ловушки, порожденных низкой плотности нейтрофилов получены перитонеальный лаваж жидкости посредником рост опухолевых клеток и вложения
Похожие видео
0 Просмотры
Изготовление кристаллических наноцеллюлозных встроенных чернил агарозного биоматериала для культуры тучных клеток, полученных из костного мозга
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение мышью перитонеальных клеток полости
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение функциональных сердечно иммунных клеток
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение мезотелиальных клеток: метод выделения первичных мезотелиальных клеток из образца ткани сальника человека
Похожие видео
0 Просмотры
Анализ дегрануляции тучных клеток для изучения действия целевого химического вещества
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение перитонеальных макрофагов Carry Out Gene Expression анализ По Toll-подобные рецепторы стимуляции
Похожие видео
0 Просмотры
Анализ функций тучных клеток In Vivo с использованием 'Mast Cell Knock-in'Mice
Похожие видео
0 Просмотры
Изоляция Брюшина производные тучных клеток и их функциональные характеристики с Ca2 +-изображений и дегрануляции анализов
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 22 августа 2026