Мечение мышиных Т-хелперных лимфоцитов с помощью радиоактивно меченых моноклональных антител

Для радиоактивного мечения мышиных Т-хелперов, Th-лимфоцитов, несущих Т-клеточный рецептор TCR, специфичный для куриного пептида овальбумина, берут пробирку, содержащую радиоактивно меченые моноклональные антитела, mAb, с желаемой радиоактивной активностью.

mAb содержит мышиный mAb, специфичный для TCR, экспрессируемый на мембране Th-лимфоцитов мыши. Хелатор конъюгирует mAb и изотоп меди, излучающий позитроны, образуя стабильный комплекс.

Разбавьте меченные радиоактивными веществами мАТ физиологическим раствором. Затем добавьте разведенные меченые радиоактивными метками мАТ в многолуночный планшет, содержащий суспензию Th-лимфоцитов. Кратко высиживайте.

В культуре меченые радиоактивными метками mAb связываются с TCR на мембранах Th-лимфоцитов. После инкубации перенесите клеточную суспензию в свежую пробирку.

центрифуга. Выбросьте надосадочную жидкость, содержащую несвязанные антитела, меченные радиоактивными метками. Ресуспендируют Th-лимфоциты в среду и переносят в многолуночный планшет. Инкубируйте в течение длительного времени.

Радиоактивно меченое связывание mAb-TCR вызывает рекрутирование адапторных белков на цитоплазматическую сторону плазматической мембраны, с которыми трискелионы клатрина связываются и образуют ямку, покрытую клатрином.

Вспомогательные белки помогают отщемлять везикулу от плазматической мембраны, способствуя интернализации меченого радиоактивным комплексом mAb-TCR в цитоплазму. В конечном счете, TCR реэкспрессируются на мембранах Th-лимфоцитов.

Меченые радиоактивными Th-лимфоцитами готовы к дальнейшим экспериментам.

Для радиоактивного мечения овальбумин-специфичных TH1-клеток курицы сначала используйте калибратор дозы, чтобы набрать 37 мегабеккерелей интересующего Т-клеточного радиоактивного антитела в шприц без мертвого объема.

Затем выдавите антитело в реакционный стаканчик, измерьте и вычтите оставшееся количество реактивности в шприце из количества, которое было набрано. Затем добавьте один миллилитр физиологического раствора в чашку, чтобы получить раствор с мощностью 37 мегабеккерелей на миллилитр.

Затем добавьте два раза по 10 к шестой клетке OVA-TH1 в 0,5 мл полной среды в каждую лунку 48-луночного планшета, а затем 20 микролитров раствора радиоактивно меченного антитела. Через 30 минут в радиационно-безопасном инкубаторе для клеточных культур с температурой 37 градусов Цельсия и 7,5% углекислым газом объедините меченые радиоактивными метками клетки в 50-миллилитровую коническую пробирку для двух промывок в 10 миллилитрах при температуре 37 градусов Цельсия PBS.