Метод in vitro для дифференцировки Т-хелперов, продуцирующих GM-CSF, от наивных Т-клеток

Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, GM-CSF секретируется GM-CSF-продуцирующими Т-хелперами или_T-HGM-клетками. Эти клетки демонстрируют низкую экспрессию других цитокинов, специфичных для Т-хелперных клеток.

Чтобы начать in vitro дифференцировку_{ТГ-клеток}, необходимо принять суспензию Т-хелперов, выделенную из селезенки мыши, содержащую антиген-активированные зрелые клетки и недифференцированные наивные клетки.

Добавьте флуоресцентно меченные антитела, нацеленные на характерные поверхностные маркеры наивных и зрелых клеток. Проведите флуоресцентно-активируемую сортировку клеток для выделения наивных Т-клеток.

Поместите клетки в лунку, покрытую антителами, которые связываются с Т-клеточным рецепторным комплексом. Добавьте антитело, которое связывается с костимулирующим рецептором. Синергетическое связывание активирует клетки.

Добавьте интерлейкин 7 — цитокин, индуцирующий дифференцировку в_{ТГ-клетки}и продукцию GM-CSF. Добавьте форбол миристата ацетат, PMA — провоспалительное соединение, иономицин — ионофор кальция и ингибитор транспорта белка.

ПМА проникает в клетку и активирует протеинкиназу. Мембранопроницаемый иономицин перемещает ионы кальция внутри клетки, повышая внутриклеточную концентрацию кальция.

Активация протеинкиназы и высокий уровень кальция инициируют сигналы, которые рестимулируют ГМ-клетки, что приводит к более высокой продукции GM-CSF. Ингибитор транспорта белка блокирует секрецию GM-CSF, способствуя внутриклеточному обнаружению.

Проводят иммунофлуоресцентное окрашивание, детектирование внутриклеточных цитокинов, а также анализируют клетки с помощью проточной цитометрии. Большинство клеток с высоким уровнем GM-CSF, но низкой экспрессией других цитокинов указывают на успешную дифференцировку в клетки GM_TH.

Чтобы изолировать CD4-положительные Т-клетки, ресуспендируйте гранулу лейкоцитов в 5 миллилитрах буфера для изоляции клеток и отфильтруйте клеточную суспензию через 30-микрометровое сетчатое фильтр в новую 15-миллилитровую пробирку, чтобы удалить любой мусор. После подсчета повторно суспендируйте клетки в соотношении 1 x 10⁷ клеток на 90 микролитров буферной концентрации и добавьте 10 микролитров анти-CD4 конъюгированных магнитных шариков на 1 x 10⁷ клеток для 15-минутной инкубации при 4 градусах Цельсия, с перемешиванием каждые 5 минут.

Пока клетки инкубируются, поместите разделительную колонку на магнитную подставку, и предварительно смочите колонку 2 миллилитрами буфера. Затем промойте клетки 5 миллилитрами буфера и повторно суспендируйте гранулу в 1 миллилитр буфера. Загрузите образец в колонку и соберите CD4-отрицательную фракцию в 15-миллилитровую коническую пробирку.

Когда все ячейки пройдут через колонну, промойте резервуар три раза 1 миллилитром буфера на промывку, прежде чем он высохнет. После последней промывки переложите колонку в новую 15-миллилитровую коническую трубку и погрузите колонку с 2 миллилитрами буфера для изоляции клеток, чтобы вытеснить положительную фракцию гранул. Затем соберите CD4-положительные клетки с помощью центрифугирования.

Для флуоресцентно-активируемой сортировки наивных Т-клеток повторно суспендируйте отсортированную гранулами CD4-положительную клеточную гранулу в 500 микролитрах буфера и смешайте клетки с соответствующим коктейлем из флуоресцентных конъюгированных антител. Через 20 – 30 минут на льду, защищенном от света, промойте клетки в 5 миллилитрах свежего буфера, и повторно суспендируйте гранулы в 500 микролитрах свежего буфера.

Отфильтруйте клетки через нейлоновую сетку и перенесите клетки в трубку FACS, предварительно закодированную 500 микролитрами буфера. Gate для выбора CD4-положительных, CD25-отрицательных и CD44 низкоклеточных популяций CD62-лигандов. Затем отсортируйте наивные CD4-положительные, CD25-отрицательные, CD-44 с низким уровнем CD-44, CD-62-лиганды с высоким содержанием Т-клеток в новую центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров и оденьте изолированные наивные CD4-положительные Т-клетки с помощью центрифугирования.

Для гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, или GM-CSF, дифференцировки Т-хелперов, ресуспендируют отсортированные Т-клетки в концентрации 1 x 10⁶ клеток на миллилитр в полной среде RPMI, содержащей 50 микромоль бета-меркаптоэтанола, и аспирируют анти-CD3 эпсилонное антитело из каждой лунки предварительно закодированного 48-луночного планшета.

Затем посейте 2,5 x 10⁵ клеток в каждую лунку вместе с IL-7, анти-CD28 и анти-ИФН гамма и инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия и 5%_CO2 в течение трех дней. На третий день культивирования используйте микроскоп, чтобы проверить дифференцировку клеток, и соберите клетки для центрифугирования.

Ресуспендируйте гранулу в свежей полной среде RPMI на две промывки, повторно суспендируя ячейки в 1 миллилитре свежей полной среды после второй промывки для подсчета. Разделите клетки на три равных объема и повторно стимулируйте первую аликвоту клеток с помощью PMA и иономицина в присутствии ингибитора транспорта белка в течение 4-6 часов.

В конце стимуляции соберите клетки для окрашивания анти-CD4 антителами. Через 30 минут зафиксируйте клетки 200 микролитрами фиксирующего буфера на 20-60 минут, после чего последует два промывки в 1 миллилитре пермеабилизационного буфера на одну промывку. Затем окрашивают для внутриклеточной экспрессии цитокинов в течение 30 минут в темноте.