Мониторинг динамики рекрутирования нейтрофилов и бактериальной нагрузки в очаге инфекции на мышиной модели

Чтобы контролировать набор нейтрофилов — основных иммунных клеток, которые способствуют выведению бактерий, начните с анестезирующей, трансгенной, иммунокомпрометированной мыши с раной, обнажающей соединительную ткань на спине.

Трансгенные нейтрофилы мышей экспрессируют усиленный зеленый флуоресцентный белок, который облегчает отслеживание нейтрофилов. Кроме того, их нарушенная способность убивать бактерии делает мышь более восприимчивой к инфекции.

Возьмем генетически модифицированный бактериальный инокулянт, обладающий биолюминесценцией — светоизлучающими характеристиками.

Введите бактериальный посевной материал в место ранения, обеспечив его доставку между соединительной тканью и фасцией — слоем фиброзной ткани под соединительной тканью. В месте инъекции бактерии размножаются и колонизируются, вызывая инфекцию тканей.

В ответ на инфекцию иммунные клетки выделяют хемокины — химические сигнальные молекулы, которые привлекают нейтрофилы. Нейтрофилы быстро мигрируют с помощью хемотаксиса — химического индуцированного движения, и экстравазируются через кровеносные сосуды в ткани, находящиеся вблизи бактериальной инфекции.

Визуализируйте мышь на наличие сигналов биолюминесценции и флуоресценции, представляющих бактериальную нагрузку и рекрутированные нейтрофилы соответственно.

Со временем увеличение биолюминесценции и сигналов флуоресценции коррелирует с увеличением бактериальной нагрузки и непрерывным набором нейтрофилов в очаге инфекции.

Для прививки от золотистого стафилококка наполните инсулиновый шприц 28-го калибра 50 микролитрами приготовленного биолюминесцентного бактериального инокулянта и пальцем оттяните дерму раненого животного в сторону. Держа шприц почти параллельно ткани, медленно вводите шприц в ткань до тех пор, пока не почувствуется резкое снижение сопротивления, свидетельствующее о проколе фасции.

С иглой, помещенной в центр раны, медленно введите весь объем инокулянта. Убедитесь, что инокулянт образует пузырь в центре раны с минимальной утечкой или рассеиванием, и медленно извлеките шприц из животного. Затем верните животное в клетку с теплом и контролем, до полного выздоровления.

После ранения и инфицирования, а также ежедневно во время эксперимента, помещайте обезболенную мышь в биолюминесцентный и флуоресцентный тепловизор с максимально ровной раной. В программном обеспечении имидж-сканера выберите «Люминесценция» и «Фотография» в качестве режимов визуализации. Время экспозиции должно быть установлено на 1 минуту при малом биннинге, F/ступень 1 для люминесценции, F/ступень 8 для фотографии и открытость для фильтра излучения. Затем нажмите «Получить», чтобы записать изображение.

Для флуоресцентной визуализации in vivo выберите Флуоресценция и Фотография в качестве режимов визуализации. Время экспозиции должно быть установлено на 1 секунду при малом биннинге, F/ступень 1 для флуоресценции, F/ступень 8 для фотографии, а также длины волн возбуждения и излучения 465 на 30 нанометрах и 520 на 20 нанометрах с высокой интенсивностью лампы соответственно. Затем нажмите «Получить», чтобы записать изображение.

После получения обоих наборов снимков верните животное в клетку с наблюдением до полного выздоровления.

Для анализа изображений откройте изображение, которое необходимо количественно оценить в соответствующей программе для анализа изображений, и поместите круглую область интереса по умолчанию на всю область раны, включая окружающую кожу. Нажмите кнопку Измерить область интереса и запишите значения среднего потока для раны, чтобы можно было построить график зависимости среднего потока каждого сигнала от времени.

Чтобы измерить заживление раны, наденьте круглую область интереса на край раны и измерьте площадь раны в квадратных сантиметрах, чтобы можно было построить график зависимости фракционного изменения от исходной линии от времени.