Идентификация ингибиторов киназы, которые модулируют реакцию тимоцитов на сильные сигналы TCR

Начните с мышей с клетками тимоцитов в многолуночной пластине. Добавьте магнитные шарики, покрытые антителами против CD3 и CD28. В подмножество лунок добавьте соответствующую концентрацию ингибитора исследуемой киназы. Инкубировать.

Антитела связываются с рецепторами CD3 и CD28 клеточной поверхности на двойных положительных тимоцитах и активируют их, вызывая подавление Т-клеточных рецепторов, TCR и активацию цитозольной протеинкиназы.

Эти протеинкиназы активируют нисходящие сигнальные пути, что приводит к увеличению экспрессии CD69 на клеточной поверхности и активации цитозольной каспазы-3. Активированная каспазаза-3 расщепляет необходимые клеточные белки, инициируя апоптоз тимоцитов.

В клетках, обработанных ингибитором киназы, ингибиторы блокируют цитозольные киназы, модулируя экспрессию CD69 и активацию каспазы-3.

Пипетка в коктейле антител, меченных флуорофорами, который связывается с корецепторами TCR, CD4 и CD8 тимоцитов, а также рецепторами CD69. Обработайте тимоциты буфером для их фиксации и пермеабилизации.

Инкубируйте с меченным флуорофором антителом против каспазы-3, которое связывается с цитозольной каспазой-3. Анализируйте тимоциты с помощью проточной цитометрии.

Контролирующие двойные положительные тимоциты экспрессируют флуоресцентные маркеры клеточной поверхности CD4, CD8 и CD69 и внутриклеточную каспазу-3 и демонстрируют подавление TCR. Напротив, тимоциты, обработанные ингибиторами, демонстрируют более низкие уровни флуоресцентных CD69 и каспазы-3.

Чтобы начать лечение тимоцитов ингибиторами киназы, с помощью многоканальной пипетки добавьте 40 микролитров на лунку тимоцитов в пластину небольшого объема. Поставьте тарелку на лед. Затем пипетку пипеткой поместите одну часть ингибиторов киназы, ДМСО и дексаметазона, а также четыре части полной среды RPMI в 96-луночный планшет.

Определите восемь лунок планшета малого объема для необработанного контроля, четыре лунки для положительного контроля на гибель клеток, обработанного дексаметазоном, путем добавления разбавленного дексаметазона в концентрации 5 микромоля, и четыре лунки для контрольной группы, обработанной носителем, путем добавления 0,5 микролитра разведенного ДМСО. Далее из соответствующих лунок ингибиторной пластины добавьте по 0,5 микролитра каждого разведенного ингибитора в 96-луночный планшет.

Чтобы начать стимуляцию тимоцитов, сначала убедитесь, что анти-CD3 и CD28 гранулы равномерно ресуспендированы. Далее промойте 1 миллилитр бусин 2 миллилитрами буфера PBS. Поставьте трубку на магнитную подставку, чтобы отделить шарики от надосадочной жидкости, и аспирируйте раствор. Затем повторно суспендируйте шарики в 1 миллилитре полной среды RPMI.

Добавьте 10 микролитров суспензии гранул на лунку к каждому образцу, обработанному ингибитором, четырем образцам, обработанным ДМСО, и четырем из 8 необработанных образцов. Добавьте 10 микролитров полного РПМИ в оставшиеся четыре необработанные лунки.

Используйте орбитальный шейкер с микропластинами, чтобы аккуратно взбалтывать пластину. Затем инкубируйте тимоциты при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислом газе в течение 17-20 часов или на ночь.

Загрунтуйте автоматизированную промывочную машину с пластинами с ламинарным потоком, сначала 150 миллилитров раствора этанола-твина, затем деионизированной водой с добавлением 1% твина-20 и, наконец, промывочным буфером FACS. В конце инкубации с помощью системы промывки пластин промойте пластину с помощью буфера для промывки FACS, используя цикл промывки девять раз. При каждой промывке добавляется и удаляется 55 микролитров промывочного буфера ламинарным потоком, что приводит к экспоненциальному разбавлению реагентов в лунках.

Чтобы окрашивать поверхностные антигены, сначала разведите один единицу объема антител против CD3, анти-CD4, анти-CD8 и анти-CD69 в 100 единицах объема буфера для промывки FACS. Затем ресуспендируйте клетки в 25 микролитрах смеси окрашивающих антител. С помощью микропланшетного орбитального шейкера осторожно взбалтывайте пластину, а затем оставьте тарелку на льду на 30 минут.

Чтобы зафиксировать ячейки, сначала промойте пластину 55 микролитрами промывочного буфера FACS, используя девятикратный цикл промывки, как описано ранее. Затем добавьте в каждую лунку по 50 микролитров буфера для фиксации и пермеабилизации. Хорошо перемешайте, и выдержите тарелку на льду в течение 30 минут. После инкубации приготовьте буфер для химической завивки/промывки, разбавив 25 миллилитров из предоставленного запаса 10x в 225 миллилитрах сверхчистой воды.

Загрунтуйте шайбу для тарелок буфером 1x и промойте тарелку 55 микролитрами буфера 1x с использованием цикла стирки из девяти раз, как описано ранее. Смешайте 1 миллилитр антитела против каспазы-3 с 2 миллилитрами 1x буфера для химической завивки и промывки. Добавьте 25 микролитров на лунку смеси в неподвижные ячейки.

Используйте орбитальный шейкер с микропластинами, чтобы аккуратно взбалтывать пластину. Оставьте тарелку на льду на час. В конце инкубации повторите этап промывки девять раз с 1x буфером для химической завивки и промывки. Затем добавьте 25 микролитров промывочного буфера FACS во все лунки планшета, пипеткой вверх и вниз несколько раз, чтобы перемешать раствор.

Наконец, переложите смешанные образцы в пробирки с микротитром. Долить в пробирки промывочный буфер FACS до общего объема 200 микролитров и приступить к анализу проточной цитометрии.