Идентификация ингибиторов киназы, которые модулируют реакцию тимоцитов на сильные сигналы TCR

Начните с мышей с клетками тимоцитов в многолуночной пластине. Добавьте магнитные шарики, покрытые антителами против CD3 и CD28. В подмножество лунок добавьте соответствующую концентрацию ингибитора исследуемой киназы. Инкубировать.

Антитела связываются с рецепторами CD3 и CD28 клеточной поверхности на двойных положительных тимоцитах и активируют их, вызывая подавление Т-клеточных рецепторов, TCR и активацию цитозольной протеинкиназы.

Эти протеинкиназы активируют нисходящие сигнальные пути, что приводит к увеличению экспрессии CD69 на клеточной поверхности и активации цитозольной каспазы-3. Активированная каспазаза-3 расщепляет необходимые клеточные белки, инициируя апоптоз тимоцитов.

В клетках, обработанных ингибитором киназы, ингибиторы блокируют цитозольные киназы, модулируя экспрессию CD69 и активацию каспазы-3.

Пипетка в коктейле антител, меченных флуорофорами, который связывается с корецепторами TCR, CD4 и CD8 тимоцитов, а также рецепторами CD69. Обработайте тимоциты буфером для их фиксации и пермеабилизации.

Инкубируйте с меченным флуорофором антителом против каспазы-3, которое связывается с цитозольной каспазой-3. Анализируйте тимоциты с помощью проточной цитометрии.

Контро