Активация макрофагов, полученных из костного мозга мыши, в ответ на антитела

После воздействия патогена макрофаги активируются и высвобождают провоспалительные и противовоспалительные цитокины, координируя реакцию иммунной системы.

Для изучения активации макрофагов, полученных из костного мозга, in vitro перенесите изолированную суспензию клеток костного мозга мыши в колбу для культур. Кратко высиживайте.

Мезенхимальные клетки, моноциты и зрелые макрофаги прилипают к поверхности колбы, в то время как гемопоэтические предшественники остаются во взвешенном состоянии.

Соберите среды, содержащие кроветворные предшественники, и центрифугу. Перенесите клетки, ресуспендированные в макрофагальном колониестимулирующем факторе, М-КСФ, среду в культуральную колбу.

M-CSF заставляет субпопуляцию миелоидных предшественников дифференцироваться в макрофаги, которые выглядят разветвленными и прилипают к колбе.

Откажитесь от неадгезивных клеточных сред. Добавьте среду M-CSF и инкубируйте. Как только макрофаги достигнут своего полностью функционального состояния, соберите их. Центрифуга.

Пластинчатые макрофаги ресуспендированы в средах M-CSF в многолуночные планшетные лунки. После прилипания макрофагов к лункам добавляют поликлональные иммуноглобулины человека и бактериальный липополисахарид, ЛПС, токсин.

Иммуноглобулины связываются со специфическими рецепторами FCγ, в то время как ЛПС связывается с Toll-подобными рецепторами на макрофагах. Эта костимуляция стимулирует активацию противовоспалительных макрофагов через нисходящие сигнальные каскады, вызывая высвобождение высоких уровней противовоспалительных цитокинов и низких уровней провоспалительных цитокинов.

Соберите цитокинсодержащие среды для дальнейшего анализа для подтверждения активации макрофагов.

Закрепите усыпленную мышь лежа на пенопластовой доске с вытянутыми конечностями, затем очистите ноги 70% этанолом. Затем сделайте неглубокий надрез глубиной около 2 миллиметров, чтобы удалить кожу и шерсть с поверхности каждой задней ноги. Затем рассеките ткани, чтобы получить доступ к голеням и бедрам.

Чтобы удалить голени и бедренные кости, разрежьте кость и мышцы чуть ниже тазобедренного сустава и выше лодыжек. Затем удалите как можно больше мышечной ткани из костей. Затем очистите кости 70% этанолом и дайте ему испариться в течение 1 минуты, затем поместите кости в 6-луночную пластину, заполненную средой для промывки костей.

В пластине обрежьте по 1 миллиметру с обоих концов бедренных костей так, чтобы их внутренние полости были открыты. Убедитесь, что игла 26-го калибра может получить доступ к полостям. Далее отделите большеберцовую и бедренную кости от коленного сустава. Затем введите иглу, прикрепленную к 10-миллилитровому шприцу, в костную полость и соберите костный мозг.

Соберите костный мозг из всех 4 костей в 50-миллилитровую коническую пробирку с 5 миллилитрами промывочной среды. Пипеткой проведите среду и костный мозг вверх и вниз несколько раз или делайте вихрь на медленной скорости, чтобы аккуратно диспергировать комки в суспензии. Нити костного мозга должны быть разбиты на мелкие пятнышки костного мозга длиной менее полумиллиметра.

Затем долейте в пробирку до 50 миллилитров средства для промывки костей и переложите ее в колбу для культуры тканей площадью 75 квадратных сантиметров. Инкубируйте костный мозг в течение часа. Во время инкубации созревшие клетки прилипнут к колбе и нужные кроветворные предшественники останутся во взвешенном состоянии. Переложите суспензию в 50-миллилитровую коническую трубку, и скрутите клетки в гранулу.

Далее выбросьте надосадочную жидкость, и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 5 миллилитрах питательной среды MCSF. Затем отрегулируйте плотность ячеек до 500 000 на миллилитр и загрузите 30 миллилитров в новую колбу площадью 75 квадратных сантиметров. Продолжайте культивирование клеток и на 4, 7 и 10 день убедитесь, что клетки адгезивы и слегка разветвлены, используя инвертированный фазово-контрастный светлопольный микроскоп.

При проверке клеток следует отказаться от среды, содержащей неадгезивные клетки. Затем промойте адгезивные клетки с помощью IMDM один раз и добавьте 30 миллилитров свежей питательной среды MSCF обратно в колбу. На 10-й день замените среду 8 миллилитрами безферментного буфера для диссоциации клеток на основе ЭДТА, чтобы собрать клетки. Кратко инкубируйте клетки, затем осторожно соскребите клетки и убедитесь, что они высвободились с помощью микроскопа.

Как только клетки будут освобождены, перенесите буфер с клетками в 50-миллилитровую коническую трубку, затем трижды промойте колбу 5 миллилитрами IMDM, чтобы собрать больше клеток. Объедините все сборы, центрифугируйте их и повторно суспендируйте гранулу в 3 миллилитрах MCSF. Теперь посчитайте клетки и отрегулируйте их концентрацию до 1 миллиона на миллилитр.

Затем налейте 100 микролитров клеточной суспензии на лунку в 96-луночный планшет с плоским дном. Вся тарелка должна быть заполняемой. Культивируйте клетки в течение примерно часа, пока они не прилипнут. Затем стимулируйте их различными концентрациями ЛПС или внутривенного иммуноглобулина, или того и другого, приготовленного в IMDM. Выполняйте все манипуляции в двух или трех экземплярах и обязательно сохраняйте необработанный контроль, затем инкубируйте клетки в течение 24 часов и анализируйте надосадочную жидкость.