Оценка вакциноиндуцированного иммунитета против бактериальной инфекции на мышиной модели

Чтобы изучить иммунитет, вызванный вакциной, сделайте инъекцию, наполненную бесклеточной коклюшной вакциной. Вакцина содержит антигенные белки бактерии, вызывающей респираторное заболевание — Bordetella pertussis, и адъюванты, которые продлевают воздействие антигена для устойчивого иммунного ответа.

Введите вакцину внутримышечно мыши, находящейся под наркозом.

После инъекции резидентные антигенпрезентирующие клетки, АПК, захватывают и перерабатывают антигенные белки в пептиды, представляя их на своей поверхности. Затем эти АПК мигрируют в близлежащие лимфатические узлы и взаимодействуют с Т-клетками, инициируя их активацию и дифференцировку в эффекторные Т-клетки.

Эти эффекторные Т-клетки циркулируют и мигрируют в различные органы, включая легкие, где они находятся в качестве резидентных Т-клеток памяти или_{Т-RM-клеток}, что приводит к иммунизации.

После иммунизации интраназально вводят устойчивый к антибиотикам штамм живого коклюша Bordetella. Эти бактерии проникают в легочную ткань и активируют_{Т-RM-клетки}. Активированные_{Т-RM-клетки} секретируют воспалительные цитокины, которые рекрутируют иммунные клетки, вызывая бактериальный клиренс.

Соберите легочную ткань мыши и гомогенизируйте ее для получения одноклеточной суспензии. Распределите разбавленную клеточную суспензию на агаровой пластине, содержащей антибиотик, и инкубируйте ее, чтобы обеспечить образование колонии бактерий.

Экстракт ткани иммунизированной мыши имеет меньше колоний по сравнению с экстрактом неиммунизированной мыши, что подтверждает индуцированный вакциной иммунитет против Bordetella pertussis.

Для иммунизации подтвердите отсутствие ответа на ущемление пальца ноги у мышей в возрасте от 6 до 12 недель, находящихся под наркозом, и загрузите в инсулиновый шприц объемом 1 миллилитр с иглой 28,5-го калибра 0,1 миллилитра интересующей вакцины. Держа шприц под углом 45 градусов скосом вверх, введите иглу примерно на 5 миллиметров в дельтовидную мышцу мыши и введите вакцину.

Удерживайте иглу введенной в мышцу от 5 до 10 секунд. Затем поверните шприц на 180 градусов так, чтобы скос был направлен вниз, чтобы создать уплотнение и предотвратить утечку вакцины, прежде чем медленно втягивать иглу от места инъекции. Затем верните мышь в клетку с контролем до полного восстановления.

Примерно через две недели после бустирования заразьте иммунизированных мышей. Возьмите мышь под наркозом за загривок тыльной поверхности за лопатками и шеей и расположите мышь вертикально, чтобы получить доступ к носу. С помощью наконечника пипетки объемом 200 микролитров медленно нанесите от 20 до 25 микролитров бактериального инокулюма на каждый слой животного, удерживая мышь, пока не будет вдохнут весь инокулюм. Затем подайте равный объем стерильного PBS одной группе мышей в качестве отрицательного контроля.

В подходящей экспериментальной конечной точке поместите инфицированную мышь вентральной стороной вверх на доску для вскрытия и закрепите конечности. Намочите тело 70% этанолом и с помощью щипцов обхватите кожу ниже живота в центре таза. С помощью острых ножниц сделайте вертикальный надрез до нижней челюсти, а кожу рассеките от брюшной стенки. Переместите кожу по бокам туши, чтобы создать беспрепятственное поле для стерильного забора органов, и захватите неповрежденную брюшину ниже грудной клетки в печени или рядом с ней. Разрежьте брюшину по направлению к грудной клетке, чтобы обнажить нижнюю часть пищеварительного тракта, и сдвиньте толстую кишку влево, чтобы открыть селезенку.

С помощью изогнутых щипцов захватите селезенку, а соединительную ткань рассеките ножницами. Затем поместите селезенку в 15-миллилитровую коническую пробирку, содержащую 3 миллилитра RPMI и 5% фетальной бычьей сыворотки на льду. С помощью щипцов стабилизируют грудную клетку в области мечевидного отростка, а диафрагму разрезать. Легкие должны сдуваться и опускаться к позвоночнику.

Разрежьте грудную клетку по бокам, чтобы удалить нагрудную пластину, и разрежьте легочные артерии и вены, чтобы изолировать и удалить верхнюю долю правого легкого. Зафиксируйте долю в 15-миллилитровой конической пробирке с 10% нейтральным буферным формалином при комнатной температуре не менее чем на 24 часа, а остальные доли правого и левого легких изолируйте. Затем поместите доли в 15-миллилитровую коническую пробирку, содержащую 2 миллилитра 1% казеина в PBS на льду.

С помощью 1-миллилитровой пипетки с наконечником соберите кровь, заполняющую грудную полость, и переведите кровь в предварительно маркированную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров на льду. Удалите околоушные, подъязычные и подчелюстные железы, а также лимфатические узлы, покрывающие трахею, а также откройте и удалите защитные мембраны, окружающие трахею. С помощью тонких щипцов и ножниц аккуратно отделите трахею от пищевода, а любую другую соединительную ткань от верхней части ключиц до нижней части нижней челюсти.

Используйте щипцы, чтобы удерживать трахею, и разрежьте трахею в верхней части ключицы. Потяните трахею вниз, чтобы максимизировать эластичность, и разрежьте трахею в нижней части нижней челюсти прямо над гортанью, изолировав около 1 сантиметра ткани. Затем поместите орган в предварительно помеченную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую 0,3 миллилитра 1% казеина в PBS на льду.

Теперь поверните мышь для удобного доступа к носу, и распылите на голову 70% этанола. Вручную схватите животное прямо за черепом, а ножницами срезайте мягкую плоть морды, начиная от нижней части носа и двигаясь вверх. Удалите шерсть, кожу и усы вокруг носа и вставьте кончики изогнутых ножниц в ноздри так, чтобы они были направлены вниз.

Разрежьте носовой проход по направлению к глазам, создав V-образное образование. Затем с помощью тонких щипцов соберите носовую перегородку и мягкие ткани внутри образования и поместите ткань в предварительно помеченную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую 0,3 миллилитра 1% казеина в PBS на льду.

Чтобы обработать легочную ткань, переложите все содержимое пробирки с образцом легких в стерильный 15-миллилитровый гомогенизатор и используйте пестик для гомогенизации ткани. Диссоциируйте образец до тех пор, пока не останутся крупные частицы ткани, и верните гомогенизированную суспензию в исходную 15-миллилитровую пробирку. Удалите аликвоту объемом 0,3 миллилитра для покрытия колониеобразующих единиц, а оставшуюся часть гомогената соберите центрифугированием.

Аликвоту 0,5 мл надосадочной жидкости в предварительно помеченные микроцентрифужные пробирки для хранения при отрицательных 20 градусах Цельсия до анализа экспрессии цитокинов методом иммуноферментного анализа. Затем последовательно разведите 0,1 миллилитров аликвот отложенной гомогенизированной легочной суспензии в 0,9 миллилитрах стерильной PBS на одно разведение и используйте стерильный треугольный распределитель для тарелки по 0,1 миллилитра каждого эмпирически выбранного разведения на предварительно маркированные 10% борде-Генгу плюс стрептомициновые планшеты.