Динамика органелл в В-лимфоцитах после активации с помощью гранул, покрытых антигеном

В-клеточные рецепторы, BCR, на В-лимфоцитах, связываются с антигенами, вызывая активацию клеток. Это приводит к интернализации антигена для переработки в пептидные фрагменты, которые загружаются в молекулы MHC класса II для представления хелперным Т-лимфоцитам для создания эффективного иммунного ответа.

Чтобы изучить активацию В-лимфоцитов in vitro с помощью гранул, покрытых антигеном, сначала получают гранулы, покрытые антигеном. Эти шарики ковалентно покрыты антигенами, лигандами, специфичными для BCR; Нереактивный белок блокирует несвязанные участки бусин, предотвращая связывание неспецифических В-лимфоцитов.

Добавьте шарики в суспензию В-лимфоцитов. Высадите смесь на покровное стекло, покрытое поли-L-лизином.

Отрицательно заряженные В-лимфоциты связываются с положительно заряженным покровным стеклом, обездвиживая клетки. Кроме того, антигены бусин специфически связываются с BCR. Взаимодействие BCR с антигеном активирует В-лимфоциты, образуя плотное соединение — иммунный синапс.

Это взаимодействие инициирует внутриклеточные сигнальные пути, что приводит к перестройке актинового цитоскелета. Это приводит к распространению клеточной мембраны с последующим сокращением, во время которого микрокластер BCR-антигена концентрируется в центре иммунных синапсов.

При ремоделировании актина центросома — организующий центр микротрубочек — перемещается рядом с синапсом. Репозиционирование рекрутирует органеллы, такие как лизосомы и аппарат Гольджи рядом с иммунным синапсом, для извлечения и присутствия антигенов.

Гранулы, покрытые антигеном, получают путем инкубации специфических лигандов с аминогранулами, предварительно обработанными глутаральдегидом, для активации аминогрупп. Ресуспендируйте активированные шарики в 100 микролитрах PBS и vortex. Тем временем приготовьте раствор антигена, добавив 100 мкг на мл BCR лиганда в 150 мкл PBS.

Далее добавьте в раствор антигена 50 микролитров активированных шариков, и выдержите в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия. Помните, что в качестве отрицательного контроля также используйте неродственный лиганд. После инкубации промойте шарик PBS, аспирируйте надосадочную жидкость и замените PBS. Повторите три раза. Затем заблокируйте свободные аминогруппы, повторно суспендировав шарики в 500 микролитрах раствора BSA. Наконец, восстановите суспендию в 70 микролитрах PBS.

Чтобы рассчитать конечную концентрацию, можно с помощью гемоцитометра подсчитать бусины. Для активации В-клеток используйте пробирку объемом 50 мл и ресуспендируйте клетки до концентрации 1,5 млн на мл в CLICK с добавлением 5% эмбриональной бычьей сыворотки. Затем добавьте 150 000 В-клеток, соответствующих 100 микролитрам смеси клеточных гранул, в покровное стекло, покрытое поли-L-лизином, и инкубируйте при температуре 37 градусов в различные временные точки.