Активация В-клеток на покровном стекле, покрытом антигеном

Активация В-клеток включает в себя распознавание антигенов рецепторами В-клеток, BCR, на их поверхности, чтобы вызвать иммунный ответ.

Чтобы изучить активацию В-клеток in vitro, начните с покровного стекла, содержащего антигены и антитела против CD45R, иммобилизованного на полимерном материале. Отрицательно заряженные антигены и антитела взаимодействуют с положительно заряженными полимерами на покровном стекле посредством электростатических взаимодействий.

Накройте покрытые покровные стекла средой, содержащей В-клетки, и инкубируйте. CD45R — трансмембранный белок В-клеток — взаимодействует с иммобилизованными антителами, способствуя клеточной адгезии.

BCR на адгезивной В-клетке взаимодействуют с антигеном, образуя иммунный синапс — координационную область для клеточной сигнализации и интернализации антигена. Это способствует ремоделированию цитоскелета и инициирует распространение клеток, что увеличивает поверхность клетки, контактирующей с антигенами.

Дальнейшее ремоделирование вызывает движение BCR-сопряженных антигенов к центру иммунного синапса. Эта клеточная перестройка вызывает смещение центросомы вблизи синаптической мембраны, которая направляет внутриклеточные органеллы, включая лизосомы, к синапсу.

Слияние лизосом с мембраной приводит к интернализации комплексов антиген-BCR. Интернализованные антигены перерабатываются в пептидные фрагменты, загружаются в основной комплекс гистосовместимости класса II или молекулы MHC и, наконец, представляются на активированных В-клетках.

Приготовьте раствор антигена, добавив анти-BCR и B220 в PBS до конечной концентрации 10 мкг/мл и 7,5 мкг/мл соответственно. Далее установите покровную крышку над крышкой из 24-луночной пластины, накрытой парафиновой пленкой, и добавьте 40 микролитров раствора антигена. Закройте пластину, а затем выдерживайте при четырех градусах в течение ночи.

Чтобы запустить активацию в coverslip, сначала промойте их PBS, и дайте им высохнуть в течение нескольких минут. Затем добавьте 150 000 В-клеток и инкубируйте при температуре 37 градусов в разные временные точки. В обоих случаях, при активации бусинами или предметными стеклами, покрытыми антигеном, мы рекомендуем начать с самого длинного временного момента, а затем переходить к более коротким.