Влияние антитела Anti C-fms на остеокластогенез в клетках костного мозга мышей in vitro

Остеокластогенез — это процесс, с помощью которого предшественники остеокластов дифференцируются и сливаются с образованием многоядерных остеокластов.

Для изучения влияния антитела анти-c-fms на остеокластогенез in vitro взяли культуральную пластину, содержащую суспензию клеток костного мозга мыши. Добавьте макрофагальный колониестимулирующий фактор, М-КСФ.

В культуре M-CSF связывается со своим специфическим рецептором, c-fms, на клетках-предшественниках миелоидов, активируя сигнальные пути и вызывая дифференцировку в макрофаги костного мозга, BMM, которые представляют собой предшественники остеокластов и прилипают к пластине.

Удалите неадгезивные клетки. Соберите BMM и засейте их в лунки с несколькими лунками. Добавка с М-КСФ и рецепторным активатором ядерного фактора каппа-Β лиганда, RANKL.

Добавьте в лунки увеличивающиеся концентрации антител против c-fms.

В контрольной лунке M-CSF связывается с рецепторами c-fms и активирует сигнальные пути, стимулируя экспрессию рецепторов RANK и способствуя выживанию и пролиферации BMM. RANKL связывается с рецепторами RANK, запуская сигнальный каскад и вызывая дифференцировку BMM и слияние в остеокласты.

В лунках с более высокими концентрациями антител антитела связываются и эффективно блокируют рецепторы c-fms и нарушают передачу сигналов, необходимую для дифференцировки остеокластов, тем самым ингибируя образование остеокластов.

Выполните окрашивание для идентификации и количественного определения популяций остеокластов и определения эффективной концентрации антител для ингибирования остеокластогенеза при образовании остеокластов, индуцированных RANKL.

Засейте 10 миллионов клеток на 10 миллилитров в 10-сантиметровую чашку для культивирования и добавьте к клеткам M-CSF. Инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа в течение 3 дней. Удалите средство через три дня, а клетки дважды, энергично, промойте 10 миллилитров PBS для удаления неадгезивных клеток.

Добавьте 5 миллилитров 0,02% трипсина-ЭДТА комнатной температуры в PBS, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа в течение 5 минут. Тщательно пипетируйте клетки, чтобы отделить их. Понаблюдайте за культурой под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки были отделены и выглядят округлыми и плавающими в среде.

Когда клетки будут отделены, инактивируйте реакцию, добавив 5 миллилитров альфа-MEM. Соберите клетки в коническую пробирку объемом 50 миллилитров и центрифугируйте при давлении 300 х г в течение 5 минут. После удаления надосадочной жидкости промойте 5 миллилитрами альфа-МЕМ и снова центрифугируйте при 300 х г в течение 5 минут. Повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах альфа-МЭМ.

Засейте 1 миллион клеток на 10 миллилитров в 10-сантиметровую чашку для культивирования, и добавьте M-CSF. Инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа в течение 3 дней. Соберите прикрепленные клетки, которые представляют собой BMM в качестве предшественников остеокластов через 3 дня. Засейте BMM из расчета 50 000 клеток на 200 микролитров альфа-MEM в 96-луночном планшете, на лунку.

В каждую лунку добавьте желаемые раздражители, а затем добавьте M-CSF для конечной концентрации 100 нанограмм на миллилитр. Добавьте антитела anti-c-fms в каждую лунку. Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа в течение 4 дней, меняя среду через день в течение 4 дней, а затем приступайте к окрашиванию и анализам, как описано в рукописи.