JoVE Encyclopedia of Experiments
Иммунология
0 просмотров • 3:52 мин • July 8th, 2025
Возьмите под наркозом самца дрозофилы дикого типа и мутанта Dicer-2 на инъекционной чашке под стереомикроскопом. Убедитесь, что в мухах нет симбиотических бактерий, подавляющих репликацию РНК-вирусов.
Инокулируйте мух внутригрудным путем с помощью нано-инъектора, содержащего суспензию одноцепочечной РНК вируса с положительным смыслом.
Вирус проникает в клетку-хозяина через рецептор-опосредованный эндоцитоз и реплицируется, продуцируя двухцепочечную промежуточную РНК. Рецептор распознавания образов хозяина Dicer-2 перерабатывает вирусную двухцепочечную РНК в небольшие интерферирующие РНК, миРНК.
МиРНК связывается с индуцированным РНК сайленсинговым комплексом RISC, где ее комплементарная цепь удаляется. Нагруженные RISC миРНК связываются с другими вирусными РНК посредством комплементарного спаривания оснований, вызывая деградацию вирусной РНК и сайленсинг генов.
Взаимодействие dicer-2 и вирусной РНК активирует нисходящие противовирусные сигнальные каскады, продуцирующие противовирусные белки. Эти противовирусные белки взаимодействуют с янус-киназой соседних клеток-хозяев, или JAK, связанными с белками цитокиновыми рецепторами, инициируя димеризацию рецепторов и фосфорилирование JAK.
Активированные JAKs фосфорилируют и активируют белки STAT, преобразователь сигнала и активатор транскрипции. Активированные STATs транслоцируются в ядро и связываются со специфическими последовательностями ДНК, инициируя транскрипцию генов противовирусного ответа.
Выращивайте мух в течение желаемого периода.
Последующий анализ указывает на снижение выживаемости и увеличение вирусной нагрузки у мутантных мух Dicer-2.
При вирусной инфекции сначала с помощью стереомикроскопа и тонких щипцов нужно сломать кончик стеклянной капиллярной иглы до подходящего диаметра для наноинъекции. Чтобы собрать инжектор, поместите уплотнительное уплотнительное кольцо и белую распорку на металлический поршень инжектора большой ямкой наружу.
С помощью шприца, оснащенного иглой 30-го калибра, заполните стеклянную иглу минеральным маслом и поместите иглу через кольцо. Поместите большее уплотнительное кольцо вокруг основания кольца, примерно в 1 миллиметре от тупого конца иглы, и установите иглу на поршень инжектора.
Закрепите иглу на поршне и нажмите пустую кнопку, чтобы продлить поршень микроинъектора до тех пор, пока не раздастся звуковой сигнал. Теперь нажмите Заполнить, чтобы втянуть поршень на 5 миллиметров, и окуните иглу в 100 бляшечно-образующую единицу вирусной суспензии. Осторожно встряхните один или по крайней мере три флакона с 20 самцами дрозофилы, не содержащими волбахии, в чашку для инъекций.
Предпочтение отдается самцам мух, так как гормональные изменения во время спаривания и размножения могут повлиять на показания у самок.
Затем введите в грудную клетку каждой мухи 50,6 нанолитров раствора вируса в область чуть более светлого цвета между мезоплеврой и тетраплеврой и измерьте нагрузку DCV с помощью анализа цитопатического эффекта и количественной ОТ-ПЦР у наземных мух, как показано выше. После инъекции осторожно переложите мух в свежий флакон и поместите флакон в горизонтальное положение, чтобы предотвратить прилипание мух к среде во время восстановления после анестезии.
В данном исследовании изучается антивирусный ответ у Drosophila путем анализа роли белка Dicer-2 в процессинге вирусной РНК. Работа освещает механизмы РНК-интерференции и последующий иммунный ответ, запускаемый вирусными инфекциями.
Точная внутригрудная наноинъекция вируса у Drosophila позволяет контролируемо исследовать взаимодействия между хозяином и вирусом, а также активацию путей врожденного иммунитета. Данный подход способствует механистическому снижению рисков и валидации мишеней для путей противовирусного ответа, что помогает принимать решения по формированию портфеля исследований на ранних стадиях изучения инфекционных заболеваний. Количественные результаты, полученные с помощью этой модели, повышают прогностическую достоверность последующих трансляционных исследований.
Данный метод применяется на стыке этапов первичного поиска и доклинической валидации, связывая исследование генетических мишеней с количественными фенотипическими показателями.
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026