Окрашивание гематоксилином и эозином для оценки повреждения толстой кишки при колите, вызванном DSS

Декстран сульфат натрия, или DSS, вызывает колит — воспалительное заболевание кишечника, при котором нарушение эпителиального барьера кишечника приводит к воспалению.

Чтобы оценить повреждение тканей, возьмите несъемную ткань толстой кишки, выделенную из мышиной модели колита, вызванного DSS. Погрузите ткань в закладную среду для легкого разрезания и быстро заморозьте.

С помощью криомикротома получить тонкий срез ткани и собрать его на предметном стекле.

Опустите предметное стекло в раствор, содержащий окисленный гематоксилиновый краситель, связанный с протравой — катионом металла — придающим красителю положительный заряд. Краситель-протравный комплекс связывается с отрицательно заряженной ДНК, окрашивая ядро в красновато-фиолетовый цвет.

Погрузите ткань в дифференцирующий кислотно-спиртовой раствор, удалив неспецифически связанный краситель из цитоплазмы и внеклеточного матрикса. Промойте ткань в синем средстве — щелочной среде — придав ядрам синий цвет, усиливающий контраст.

Погрузите предметное стекло в увеличивающуюся концентрацию спирта, чтобы обезвоживать ткани, усиливая проникновение противопятна.

Опустите ткань в противокраситель — кислый раствор эозина — придающий розовый цвет основным цитоплазматическим белкам и внеклеточному матриксу. Промойте предметное стекло спиртом, чтобы удалить излишки эозина. Окуните ткань в ксилол, чтобы сделать ткань прозрачной — для лучшего микроскопического исследования.

Под микроскопом на срезе толстой кишки видно усугубленное повреждение тканей, что указывает на колит, вызванный DSS.

Для окрашивания изолированной ткани толстой кишки гематоксилином и эозином на следующее утро погрузите кусочки ткани в 30% сахарозу в PBS на ночь в отдельные 15-миллилитровые пробирки для криозащиты образцов. На следующий день поместите ткани в оптимальную температуру резки или ОКТ-соединение и охладите ткани до минус 20 градусов Цельсия до тех пор, пока ОКТ не затвердеет.

Поместите блоки ОКТ в криостат и установите шкалу толщины на 12 микрометров, затем нарежьте и соберите замороженные срезы толщиной 12 микрометров на предметные стекла микроскопа. Когда все ткани будут разрезаны, нагрейте предметные стекла при температуре 65 градусов Цельсия на горячей плите в течение 20 минут и кратковременно промойте нагретые срезы в дистиллированной воде перед окрашиванием раствором для окрашивания гематоксилином в течение 5 минут.

Удалите избыток раствора гематоксилина в проточной водопроводной воде в течение 5 минут и дифференцируйте участки с 0,5% соляной кислотой в этаноле в течение 30 секунд, после чего прополощите 1 минуту под проточной водой из-под крана. Далее промойте образцы в течение 1 минуты в PBS, после чего еще 5 минут промойте под проточной водой из-под крана.

В конце мытья погрузите салфетки в восходящий этанол на 10 секунд за погружение, после чего погрузите в эозин на 2 минуты. Для обезвоживания образцов погрузите предметные стекла в 95% этанол и 2 смены 100% этанола на 5 минут за погружение, а затем очистите двумя 5-минутными изменениями ксилола. Затем оцените повреждение тканей проксимальной, средней и дистальной отделов толстой кишки в каждой экспериментальной группе.