Синтез биопленки in vitro золотистым стафилококком

Бактериальные биопленки представляют собой трехмерные структуры, состоящие из бактериальных сообществ, встроенных в самогенерирующийся внеклеточный матрикс, которые уклоняются от иммунного ответа хозяина.

Для получения биопленки Staphylococcus aureus in vitro перенесите активно растущую суспензию Staphylococcus aureus нужной плотности клеток в лунки, покрытые поли-L-лизином, многолуночного планшета.

Во время инкубации в статических условиях положительно заряженное покрытие из поли-L-лизина способствует электростатическому взаимодействию с отрицательно заряженными гликополимерами, такими как тейхоевые кислоты, на поверхности бактерий, способствуя прикреплению бактерий.

При наличии доступных источников питательных веществ золотистый стафилококк делится и накапливается, образуя микроколонии. Кроме того, бактерии выделяют внеклеточный матрикс, состоящий из полисахаридов, белков и внеклеточной ДНК, который обволакивает клетки и способствует бактериальной когезии и поверхностной адгезии.

При непрерывном делении клеток и секреции матрикса биопленка созревает в трехмерную структуру с эффективным распределением сигнальных молекул для коммуникации между клетками.

При достижении пороговой бактериальной плотности золотистый стафилококк выделяет протеазы и нуклеазы, разрушая биопленочный матрикс и выделяя в среду некоторое количество золотистого стафилококка. Удалите среды, содержащие свободно плавающие планктонные бактерии.

Аккуратно добавьте буфер, чтобы предотвратить разрушение биопленки. Удалите буфер, содержащий все оставшиеся неприкрепленные бактерии.

Сгенерированная биопленка готова к последующим экспериментам.

Начните с получения изолированных колоний золотистого стафилококка из криоконсервированного поголовья с использованием метода полосовой пластины на богатой питательными веществами агаровой пластине, такой как триптический соевый агар. Покройте отдельные лунки 96-луночной пластины 100 микролитрами ФАПЧ, разведенными в стерильной воде, и выдержите при комнатной температуре в течение 30 минут. Аспирируйте раствор ФАПЧ асептически с помощью вакуумной аспирационной ловушки. Дайте лункам высохнуть в течение ночи при комнатной температуре.

Приготовьте ночную культуру, инокулировав колонию S. aureus в MEM-альфа с добавлением 2% глюкозы, и инкубируйте ее при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16–18 часов со скоростью 200 оборотов в минуту. Разведите культуру на ночь, переложив 50 микролитров на 5 миллилитров свежего MEM-альфа с добавлением 2% глюкозы. Затем инкубируйте его при температуре 37 градусов Цельсия со скоростью 200 оборотов в минуту до достижения среднелогарифмической фазы. Используйте MEM-alpha для нормализации среднелогарифмической культуры до OD 0,1.

Перенесите 150 микролитров нормализованной культуры в каждую лунку обработанного ФАПЧ 96-луночного планшета. Инкубируйте планшет во влажной камере при температуре 37 градусов Цельсия в течение 18-20 часов. Аспирируйте надосадочную жидкость, чтобы удалить планктонные клетки. Аккуратно промойте оставшуюся биомассу 150 микролитрами HBSS, чтобы удалить неприкрепленные клетки. Повторите не менее двух раз, чтобы удалить все планктонные клетки.