Метод in vitro для стимуляции лимфоцитов с помощью патогенных бактерий

Чтобы стимулировать лимфоциты с помощью Haemophilus influenzae — патогенной бактерии, принимайте суспензию изолированных мононуклеарных клеток периферической крови, или PBMC, включая лимфоциты и антигенпрезентирующие клетки или APC.

Добавьте бактериальную суспензию и инкубируйте при физиологической температуре.

Рецепторы распознавания образов на АПК связываются со специфическими компонентами бактериальных клеток, запуская фагоцитоз. Фагосома, содержащая интернализованные бактерии, сливается с лизосомой, вызывая бактериальную деградацию и переработку в пептидные фрагменты.

Молекулы главного комплекса гистосовместимости или MHC связываются с пептидными фрагментами и представляют их на поверхности клетки в виде антигенов. Т-лимфоциты связываются с представленным антигеном через Т-клеточный рецептор.

Добавьте костимулирующие антитела, которые связываются со специфическими поверхностными рецепторами на Т-лимфоцитах. Синергическое связывание индуцирует нисходящую передачу сигналов, активируя выработку цитокинов Т-лимфоцитов.

Добавьте соединение,

блокирующее Гольджи, блокирующее транспорт везикулярного белка из эндоплазматического ретикулума в Гольджи, чтобы ингибировать секрецию цитокинов из Т-лимфоцитов, способствуя внутриклеточному накоплению цитокинов.

Добавьте фиксатор для сохранения клеточной морфологии и детергент для проникновения в клеточную мембрану. Добавьте коктейль флуоресцентно меченых антител, включая антитела, связывающиеся с Т-лимфоцит-специфичными поверхностными маркерами, маркирующими поверхность клетки, и цитокин-специфические антитела, которые проникают внутрь клетки для связывания внутриклеточных цитокинов.

Проточная цитометрия для обнаружения клеток с двойной флуоресценцией, указывающей на продукцию цитокинов стимулированными Т-лимфоцитами.

Разделите образец периферической крови на аликвоты для контроля и стимуляции антигена. Добавьте костимулирующие антитела к обоим образцам, затем добавьте нетипируемую H. influenzae к образцу антигена и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 1 часа.

Далее добавьте к образцам блокатор Гольджи Брефельдин А, и инкубируйте их еще пять часов. После лизиса эритроцитов, как было показано ранее, зафиксируйте лейкоциты с помощью 500 микролитров параформальдегида от 1% до 2% в течение 1 часа. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра, затем проникните 1 миллион клеток 100 микролитрами 0,1% сапонина в течение 15 минут.

Затем инкубируйте клетки с соответствующими флуоресцентными мечеными антителами. Промойте клетки, затем проанализируйте их с помощью проточного цитометра. Определите долю антиген-реагирующих клеток путем гейтирования соответствующих популяций лимфоцитов. Проводите фоновое окрашивание нестимулированных клеток для всех анализируемых цитокинов.