$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Во время инфекции активированные лимфоциты высвобождают медиаторы воспаления — цитокины — чтобы вызвать иммунный ответ.
Чтобы количественно определить медиаторы воспаления в инфицированной ткани, начните с клеточной суспензии, содержащей иммунные клетки, полученные из легочной ткани человека.
Инкубируйте клетки с Haemophilus influenzae — респираторной патогенной бактерией. Поверхностные антигены бактерий взаимодействуют с рецепторами распознавания образов на фагоцитарных иммунных клетках. Это инициирует интернализацию бактерий, процессинг в более мелкие пептиды и презентацию пептида основной молекулой комплекса гистосовместимости.
Молекула антигена MHC-II на фагоцитарных клетках связывается с Т-лимфоцитами через рецепторы Т-клеток, наряду с костимулирующими взаимодействиями рецепторов, что приводит к активации Т-лимфоцитов и выработке провоспалительных цитокинов.
Обрабатывайте клетки блокаторами Гольджи, нарушающими высвобождение цитокинов, вызывающих их накопление внутри клеток. Промойте клетки блокирующим буфером, чтобы заблокировать неспецифические сайты связывания.
Окрашивайте клеточную суспензию смесью меченых флуорофорами антител, которые специфически связываются с маркерами поверхности Т-лимфоцитов человека, обеспечивая мечение лимфоцитов.
Зафиксируйте клетки, и пропитайте их с помощью порообразующего поверхностно-активного вещества. Инкубируйте пермеабилизированные клетки с мечеными флуорофорами антицитокиновыми антителами, которые проникают в клетки и взаимодействуют со специфическими цитокинами.
С помощью проточной цитометрии измерьте сигнал флуоресценции цитокинов в меченых лимфоцитах, коррелируя с продукцией медиатора воспаления из-за бактериальной инфекции.
Разрежьте от 20 до 40 граммов образца лобэктомии на срезы объемом от 3 до 5 кубических миллиметров. Поместите их в стерильную камеру объемом 50 микролитров и механически фрагментируйте ткань с помощью соответствующего дезагрегатора. После дезагрегации тканей лизируйте эритроциты, как показано, и ресуспендируйте клетки в стерильных RPMI. Затем отфильтруйте клетки через стерильную нейлоновую сетку толщиной 100 микрометров и подсчитайте количество жизнеспособных клеток с помощью метода исключения трипанового синего.
Для анализа на инфекцию ресуспендируйте клетки легких в RPMI до конечной концентрации 4 миллиона клеток на миллилитр в пробирке. Затем заражайте клетки с MOI 100 бактерий на клетку. Ослабьте крышку на полоборота, чтобы обеспечить передачу газа в трубках. Поместите клетки в вращатель трубки и инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия, вращая при этом со скоростью 12 оборотов в минуту. Через час после стимуляции добавьте брефельдин А, чтобы предотвратить внеклеточный экспорт цитокинов, и инкубируйте клеточные суспензии в течение еще 16-22 часов с вращением.
На следующий день промойте клеточную суспензию 500 микролитрами PBS, содержащими 1% бычьего сывороточного альбумина и 0,01% азида натрия. Затем оставайтесь в клеточной суспензии для специфических маркеров поверхности лимфоцитов человека в течение одного часа. Затем промойте клетки PBS и закрепите и пропитайте их, как было показано ранее. Затем инкубируйте клетки с внутриклеточными антителами, окрашивающими цитокины, в течение одного часа. Затем промойте клетки и повторно суспендируйте их в 100 микролитрах PBS перед получением данных на проточном цитометре.