Определение продукции нейтрофилов АФК при взаимодействии с опсонизированной биопленкой

Бактерии, помеченные опсонинами, распознаются по специфическим нейтрофильным рецепторам, что вызывает фагоцитоз активных форм кислорода, или АФК, высвобождение и бактериальную деградацию.

Чтобы количественно оценить продукцию нейтрофилов АФК in vitro, возьмите многолуночный планшет. Тестовая лунка содержит биопленку Staphylococcus aureus, содержащую бактерии, встроенные в пленку внеклеточного матрикса. Контрольная лунка находится без биопленки.

Инкубируйте биопленку с сывороткой крови человека, позволяя сывороточным опсонинам опсонизировать биопленку.

Отсадите сыворотку. Промойте буфером, удаляя несвязанные опсонины. Добавьте в лунки нейтрофилы и люминол — хемилюминесцентное соединение. Центрифуга, поднося нейтрофилы к биопленке.

С помощью считывателя пластин измерьте люминесценцию с течением времени.

В лунке, содержащей биопленку, нейтрофилы связываются с опсонинами биопленки, вызывая активацию нейтрофилов и интернализацию бактерий в фагосомы. Активируются специфические сигнальные пути, вызывающие сборку NADPH-оксидазы на фагосомах.

Оксидаза NADPH катализирует перенос электронов от NADPH к молекулярному кислороду, генерируя АФК, которые разлагают бактерии. Кроме того, NADPH-оксидаза на клеточной мембране высвобождает внеклеточные АФК.

В ответ биопленочные бактерии вырабатывают ферменты, нейтрализующие АФК и высвобождающие лейкоцидины, которые образуют поры в мембранах нейтрофилов и вызывают лизис, нарушая выработку АФК. Люминол вступает в реакцию с АФК, вызывая его возбуждение, и при расслаблении излучает люминесценцию.

Тестовая лунка демонстрирует повышенные уровни АФК по сравнению с контролем, что указывает на взаимодействия нейтрофилов и опсонизированных биопленок.

Добавьте 100 микролитров 20% нормальной человеческой сыворотки, разведенной в HBSS, по каплям, в промытую биопленку и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут, чтобы опсонизировать биопленку. Отсадите раствор сыворотки и промойте биопленки по каплям 150 микролитрами HBSS. Отсасывайте HBSS, оставляя после себя лунки с опсонизированными биопленками.

Добавьте люминол к нейтрофилам, ресуспендированным в HBSS, чтобы получить конечную концентрацию 5 микромолярного люминола. Этот раствор готов к применению для групп А и С. Добавьте в лунки с опсонизированными биопленками нейтрофилы, смешанные с люминолом.

Для группы D приготовьте 50 микромолярный раствор люминола в HBSS в отдельной пробирке без нейтрофилов и добавьте его в лунку, содержащую биопленку. Аликвотируйте 350 микролитров нейтрофилов в смеси с люминолом, и добавьте в смесь PMA в конечной концентрации 500 нанограмм на миллилитр.

Для группы В добавляйте нейтрофилы из этой смеси в лунки без биопленки. Это служит положительным контролем. Центрифугируйте планшет при температуре 270 RCF в течение 30 секунд при температуре 4 градуса Цельсия. Убедитесь, что считыватель пластин настроен на 37 градусов Цельсия, люминесцентное и кинетическое считывание в течение 60 минут с 3-минутными интервалами.

Поместите планшет в считыватель планшетов, чтобы измерить выработку нейтрофилами АФК в течение 60 минут.