Анализ in vitro для изучения взаимодействия нейтрофилов и биопленки

Биопленка представляет собой сообщество поверхностно адгезивных бактерий, встроенных в матрицу внеклеточных полимерных веществ, ЭПС, микробного происхождения.

Для изучения взаимодействия иммунных клеток с биопленкой in vitro берут предметное стекло с каналом, содержащим биопленку золотистого стафилококка — условно-патогенного микроорганизма. Сконструированные бактерии экспрессируют флуоресцентный белок для микроскопического обнаружения. Канал соединяется с резервуарами, заполненными средой для снабжения бактерий питательными веществами.

Добавьте суспензию нейтрофилов, меченную флуоресцентным клеточным красителем. Среда также содержит гомодимер этидия, который окрашивает ДНК мертвых клеток. Инкубируют в физиологических условиях.

Рецепторы распознавания образов на нейтрофилах связываются с патоген-ассоциированными молекулярными паттернами на бактериях. Связывание заставляет нейтрофилы фагоцитозировать бактерии и производить внеклеточные активные формы кислорода или АФК, убивая бактерии.

Чтобы уклониться от иммунного ответа, бактерии выделяют детоксикационные ферменты, которые уменьшают количество АФК, и лейкоцидиновый токсин, вызывающий гибель клеток. Мономерный лейкоцидин связывается со специфическими рецепторами на нейтрофилах и подвергается мультимеризации, образуя поры, нарушая целостность мембраны и убивая клетки.

Гомодимер этидия проникает через поврежденную клеточную мембрану, окрашивая мертвые клетки.

Под широкопольным флуоресцентным микроскопом подмножество бактериальных клеток и нейтрофилов выглядит мертвым, что указывает на взаимодействие нейтрофилов с биопленкой.

Используйте флуоресцентный штамм S. aureus, такой как USA300, экспрессирующий GFP, для облегчения микроскопической визуализации. Инкубируйте нейтрофилы со 100 микромолярными BCD в течение 30 минут в коромысле при температуре 37 градусов Цельсия с 5% атмосферного углекислого газа. Убедитесь, что образцы инкубируются в темноте, и ограничьте воздействие света.

Чтобы смыть избыток BCD, центрифугируйте нейтрофилы при 270 RCF в течение пяти минут и аспирируйте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте нейтрофилы в свежем HBSS. Затем добавьте гомодимер этидия-1 к нейтрофилам, окрашенным BCD, в конечной концентрации 4 микромоля для мониторинга гибели нейтрофилов и бактерий.

Промойте биопленку с помощью HBSS и добавьте 150 микролитров нейтрофилов в биопленку S. aureus, выращенную на микрослайдах. Инкубируйте микрослайды во влажной камере в течение 30 минут. Количество бактериальных клеток будет основано на количестве клеток, полученном в результате 18-часового осаждения биопленки.

Визуализируйте взаимодействие биопленки нейтрофилов с помощью флуоресцентных каналов, соответствующих длинам волн возбуждения и излучения флуоресцентных красителей или белков.