Уничтожение клеток K562 мононуклеарными клетками периферической крови, подвергшихся воздействию препаратов табачных изделий

Опухолевые клетки активируют эффекторные иммунные клетки, высвобождая цитокины и цитолитические гранулы, содержащие перфорин и гранзимы. Перфорин образует поры в мембране опухолевой клетки, облегчая проникновение гранзима в клетку и инициируя апоптоз, вызывающий гибель клеток.

Для анализа цитолитической функции мононуклеарных клеток периферической крови человека, ПМК после приготовления табачного изделия, ТТП, воздействия берут многолуночный планшет с повышением концентраций ТПП. В качестве средства контроля выступает средасодержащая скважина.

Добавьте суспензию PBMC. Никотин, основной иммунодепрессант ТПП, связывается с никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами эффекторных ПМЦ, подавляя выработку провоспалительных цитокинов.

центрифуга. Удалите ТПП-содержащую надосадочную жидкость. Повторная приостановка работы КПМП в СМИ. Добавьте в лунки флуоресцентно меченые клетки K562, лейкозные клетки человека, обладающие повышенной восприимчивостью к цитотоксичности эффекторных клеток PBMC.

Эффекторные клетки, обработанные TPP, с подавленным иммунным ответом демонстрируют сниженную экспрессию перфорина и высвобождение цитокинов, снижая цитолитическую способность PBMC.

центрифуга. Ресуспендирование клеток в буфере с последующим нанесением непроницаемого для клеток флуоресцентного красителя. Краситель попадает в клетки с поврежденными мембранами и окрашивает ДНК.

С помощью проточного цитометра определить долю мертвых и живых клеток K562 в лунках. Более низкий процент мертвых клеток K562 в лунках с более высокими концентрациями TPP, чем в контроле, указывает на подавление уничтожения клеток K562 PBMC, обработанными TPP.

После приготовления тарелки с обработанными табачными изделиями PBMC, как показано выше, промойте культуру клеток K562, собранных при 80% конфлюенции в 10 миллилитрах DPBS. Повторно суспендируйте гранулу в 5 миллилитрах DPBS, и подсчитайте ячейки. Затем добавьте 1 миллилитр свежеприготовленного рабочего раствора CFSE в 1-2 раза по 10 к седьмой клетке K562 на 1 миллилитр готовой среды и диспергируйте клеточное окрашивание путем вортексирования.

Инкубируйте клетки при комнатной температуре. Ровно через 2 минуты добавьте 200 микролитров FBS, и снова переведите клетки в вихрь, инкубируя их еще две минуты.

После второй инкубации промойте клетки в 10 миллилитрах готовой среды. Затем повторно суспендируйте гранулу еще в 10 миллилитрах полной среды и подсчитайте ячейки. Теперь центрифугируйте обработанные табаком PBMC и сцедите надосадочную жидкость. Затем установите крышку на место, повторно суспензируйте ячейки с помощью вортекса и промойте их в 200 микролитрах полной среды на лунку.

Чтобы начать анализ на убийство, добавьте меченые CFSE клетки K562 в PBMC в соотношении 1 к 15 и инкубируйте ко-культуру при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.

Через пять часов раскрутите клетки вниз и выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулы с помощью вортекса, а затем промойте ячейки 200 микролитрами проточного буфера на лунку. Затем добавьте 95 микролитров проточного буфера, а затем 5 микролитров 7-AAD, чтобы общий объем составил 100 микролитров на лунку.

Наконец, инкубируйте клетки в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут, затем добавьте по 100 микролитров проточного буфера в каждую лунку и перенесите весь объем в соответствующие пробирки FACS для определения процентного соотношения 7-AAD и CFSE-положительных клеток с помощью проточного цитометрического анализа.