Количественная оценка бактериальной инфекции в клетках-хозяевах с помощью анализа колониеобразующих единиц

Чтобы начать анализ колониеобразующей единицы, или КОЕ, для количественного определения жизнеспособных бактерий, возьмите многолуночный планшет, содержащий культивируемые макрофаги в питательных средах. Инфицируйте макрофаги Listeria monocytogenes, патогенной бактерией, способной к внутриклеточному росту.

Во время инфекции макрофаги поглощают бактерии, интернализуя бактерии в мембранном компартменте — фагосоме.

Бактерии выделяют порообразующий токсин и разрушают фагосомную мембрану. Таким образом, бактериям разрешается проникать в цитозоль и размножаться в макрофагах.

Кратко обработайте инфицированные макрофаги гентамицином, антибиотиком, который избирательно устраняет неинтернализованные бактерии, сохраняя при этом внутриклеточные бактерии.

Аспирируйте вышележащую среду, содержащую антибиотики. Далее добавьте стерильную дистиллированную воду поверх инфицированных макрофагов, создав гипотоническую среду. Это приводит к осмосу, когда молекулы воды попадают в клетки и вызывают лизис макрофагов, высвобождая внутриклеточные компоненты, в том числе бактерии.

Распределите клеточный лизат, содержащий внутриклеточные бактерии, на лизогенную агаровую пластину, способствуя разделению отдельных бактериальных клеток и обеспечивая их самостоятельный рост. Во время инкубации жизнеспособные бактерии растут на поверхности агара и образуют отдельные колонии.

Подсчитайте колонии на планшете и получите КОЕ, представляющие внутриклеточные бактерии, которые уклонились от иммунного ответа хозяина и успешно реплицировались в инфицированных макрофагах.

Чтобы собрать урожай, слегка наклоните чашку и осторожно с помощью пипетки удалите всю среду из лунки. Добавьте в лунку 0,5 миллилитра дистиллированной стерильной воды. Через 30 секунд переложите полученный лизат воды в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную пробирку и энергично завихривайтесь в течение 10 секунд.

Добавьте 4,5 микролитра и 50 микролитров лизата воды в 450 микролитров дистиллированной стерильной воды для приготовления 10-кратного и 100-кратного разведения. Короче говоря, вортекс для обеспечения тщательного перемешивания. Добавьте 50 микролитров исходных 10-кратно разбавленных и 100-кратно разведенных образцов на лизогенные бульонные агаровые тарелки и распределите с помощью планшетного разбрасывателя.

Чтобы определить эмерджентный Lm, извлеките 10 микролитров перекрывающего материала из чашки и разделите его на две аликвоты по 5 микролитров в микроцентрифужных пробирках. Добавьте 5 микролитров DMEM/FCS к одной аликвоте и добавьте 5 микролитров DMEM/FCS, содержащих 5 микролитров гентамицина на миллилитр, во вторую аликвоту в качестве контроля.

Подождите 5 минут при комнатной температуре. Добавьте в каждую аликвоту 90 микролитров дистиллированной стерильной воды и энергично перебейте пробирку в течение 10 секунд. Затем добавьте 50 микролитров образца на агаровые пластины LB и распределите с помощью разбрасывателя пластин. Храните планшеты в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух дней перед подсчетом колоний Lm.