JoVE Encyclopedia of Experiments
Иммунология
0 просмотров • 4:21 мин • July 8th, 2025
Возьмите многолуночный планшет, содержащий культуру макрофагов. Инфицировать флуоресцентными белками, экспрессирующими Listeria monocytogenes, Lm.
Белки на Lm связываются со специфическими рецепторами макрофагов, интернализуя бактерии в фагосоме. Кроме того, Lm выделяет порообразующие токсины, которые разрушают фагосомную мембрану, высвобождая бактерии в цитозоль, где они размножаются и окружаются актиновыми филаментами хозяина.
Белки ActA, индуцирующие сборку актина, на Lm индуцируют непрерывную полимеризацию актина в задней части бактерии. Сгенерированный хвост актиновой кометы продвигает Lm через цитозоль и проникает через мембрану клетки макрофага, высвобождая в среду полимеризованный Lm, покрытый актином.
После инкубации соберите и закрепите внеклеточные, связанные с актином, Lm-содержащие среды из набора лунок. Зафиксируйте Lm с помощью параформальдегида. Добавьте дистиллированную воду, разрывая макрофаги и высвобождая внутриклеточный Lm. Соберите внутриклеточный Lm и зафиксируйте образец с помощью параформальдегида.
В других лунках замените среды непроницаемыми для клеток гентамицинсодержащими средами для устранения внеклеточного Lm. Замените на свежие среды и выдержите в течение нужного срока.
После инкубации соберите внеклеточные Lm-содержащие среды и зафиксируйте образец параформальдегидом. Используйте дистиллированную воду для получения лизата, содержащего внутриклеточный Lm, и закрепите образец параформальдегидом. Добавьте в образцы флуоресцентно меченный фаллоидин, который избирательно связывается с полимеризованным актином.
С помощью проточного цитометра визуализируйте флуоресцентные сигналы от Lm и актин-связывающего фаллоидина в образцах. Количественно оцените внеклеточный и внутриклеточный Lm, связанный с актином, полученный из инфицированных макрофагов.
С помощью автоматизированного счетчика клеток отрегулируйте приготовленные RAW 264,7 клеток до концентрации 1 х 106 клеток на миллилитр. Добавьте 1 миллилитр образца в лунки 6-луночного планшета для культуры тканей. Заражайте клетки приготовленным Lm инокулюмом, соответствующим кратности инфекции 50.
Через 1,5 часа после заражения в 1,5-миллиметровую микроцентрифужную пробирку, заполненную 500 микролитрами 4% PFA, соберите среду из первого набора лунок и положите пробирку на лед. Чтобы собрать внутриклеточный Lm, добавьте в каждую лунку по 1 миллилитру дистиллированной стерильной воды. Через 60 секунд переложите полученный лизат воды в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную пробирку с 500 микролитрами 4% PFA. Энергично закрутите трубку в течение 10 секунд и положите ее на лед.
Оставшиеся лунки удалите среду и замените 1 миллилитром DMEM/FCS с 5 микрограммами на миллилитр гентамицина для уничтожения внеклеточного Lm. Немедленно верните чашку в инкубатор.
Через 30 минут удалите носитель и замените на DMEM/FCS без гентамицина. Еще через два и четыре часа соберите среды в лизаты для второй и третьей временных точек в пробирки и положите их на лед для охлаждения. Центрифужируйте пробирки при 10 000 раз g в течение 7 минут.
С помощью пипетки удалите надосадочную жидкость, не потревожив гранулу. Добавьте в тюбик красящий коктейль, содержащий 50 микролитров 4% PFA и 15 микролитров фаллоидина, и перемешайте для ресуспензии каждой гранулы. Инкубируйте пробирки в темноте при температуре 4 градуса Цельсия в течение 20 минут.
После инкубации добавьте 1 миллилитр буфера FACS в каждую пробирку и проведите пипеткой вверх и вниз для смешивания. Вращайте пробирки в центрифуге при 10 000 умноженных на g в течение 7 минут. Удалите надосадочную жидкость, не потревожив гранулы.
Для немедленного использования суспендируйте каждую гранулу в 400 микролитрах буфера FACS. Если вы храните для последующего анализа, добавьте в пробирку 200 микролитров буфера FACS и 200 микролитров 4% PFA и перемешайте для суспендирования.