Методика in vitro для изучения формирования инфламмасомного комплекса в макрофагах

0 просмотров3:06 мин • July 8th, 2025

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Начните с планшета, содержащего культуру первичных макрофагов.

Введение бактериального липополисахарида (LPS), который связывается с толл-подобными рецепторами на макрофагах, вызывая активацию белка семейства NLR, содержащего пириновый домен 3 или NLRP3.

Добавьте ионофор, который опосредует отток ионов калия. Снижение цитозольного калия активирует NLRP3. Активированный NLRP3 олигомеризует и индуцирует рекрутирование адапторного белка, который, в свою очередь, рекрутирует про-каспазу-1, образуя инфламмасому.

Аутопротеолиз превращает про-каспазу-1 в активную каспазу-1, которая опосредует гибель воспалительных клеток или пироптоз. Повреждение ДНК при пироптозе приводит к конденсации ядер.

Зафиксируйте клетки и обработайте их моющим средством, чтобы проникнуть в них.

Добавьте первичное антитело, связывающееся с адапторным белком, ассоциированным с инфламмасомой, и флуоресцентно меченное вторичное антитело, которое связывается с первичным антителом, мечая инфламмасому.

Введите флуоресцентный краситель для нуклеиновой кислоты, чтобы пометить ядро. Под флуоресцентным микроскопом клетки демонстрируют конденсированные ядра, что указывает на пироптоз, и очаги адапторных белков, указывающие на образование инфламмасом.

Для иммунофторхимического анализа клеток, обработанных нигерицином, промойте помеченные зондом клетки и инкубируйте клетки в 250 микролитрах раствора фиксации и пермеабилизации на лунку в течение 30 минут на льду, защищенном от света.

Промойте макрофаги еще три раза свежим буфером для промывки и пометьте клетки 250 микролитрами первичного антитела против связанного с апоптозом пятнистовидного белка, содержащего С-концевой домен рекрутирования каспазы, или ASC, на лунку в течение одного часа на льду.

Промойте клетки в конце инкубации и пометьте образцы 250 микролитрами соответствующего вторичного антитела, конъюгированного флуоресцентным красителем, в течение еще одного часа на льду, добавив 4 микролитра соответствующего флуоресцентного ядерного окрашивающего красителя в течение последних 5 минут.

После 3-кратной промывки ячеек в буфере холодной промывки установите покровные стекла на предметные стекла с 7 микролитрами монтажной среды, препятствующей выцветанию, как показано на рисунке, и визуализируйте макрофаги с помощью флуоресцентной конфокальной микроскопии.

08:47

Освещение пути к Caspase активации с помощью Bimolecular флуоресценции дополнения

Похожие видео

0 Просмотры

08:41

Визуализация воспалительных каспаз, индуцированных близостью в макрофагах, полученных из моноцитов человека

Похожие видео

0 Просмотры

10:23

Оценка активации каспазы для оценки гибели врожденных иммунных клеток

Похожие видео

0 Просмотры

05:19

Визуализация активации каспаз в моноцитарных макрофагах человека

Похожие видео

0 Просмотры

03:44

Выявление активации инфламмасом с помощью флуоресцентной микроскопии

Похожие видео

0 Просмотры

04:01

Оценка активации множественных каспаз в макрофагах

Похожие видео

0 Просмотры

09:04

Активация и Измерение NLRP3 Inflammasome деятельности Использование IL-1β в человека моноцитов дендритные клетки

Похожие видео

0 Просмотры

12:47

Использование РНК-интерференции по расследованию врожденного иммунного ответа у мышей макрофагов

Похожие видео

0 Просмотры

07:54

Высокоэффективная Трансфекцию человека THP-1 макрофагов по Nucleofection

Похожие видео

0 Просмотры

10:07

"Фагосоме Закрытие Анализ" для визуализации фагосоме Формирование в трех измерениях с помощью полного внутреннего отражения флуоресцентной микроскопии (TIRFM)

Похожие видео

0 Просмотры

Последнее обновление: 1 августа 2026