Методика in vitro для изучения формирования инфламмасомного комплекса в макрофагах

Начните с планшета, содержащего культуру первичных макрофагов.

Введение бактериального липополисахарида (LPS), который связывается с толл-подобными рецепторами на макрофагах, вызывая активацию белка семейства NLR, содержащего пириновый домен 3 или NLRP3.

Добавьте ионофор, который опосредует отток ионов калия. Снижение цитозольного калия активирует NLRP3. Активированный NLRP3 олигомеризует и индуцирует рекрутирование адапторного белка, который, в свою очередь, рекрутирует про-каспазу-1, образуя инфламмасому.

Аутопротеолиз превращает про-каспазу-1 в активную каспазу-1, которая опосредует гибель воспалительных клеток или пироптоз. Повреждение ДНК при пироптозе приводит к конденсации ядер.

Зафиксируйте клетки и обработайте их моющим средством, чтобы проникнуть в них.

Добавьте первичное антитело, связывающееся с адапторным белком, ассоциированным с инфламмасомой, и флуоресцентно меченное вторичное антитело, которое связывается с первичным антителом, мечая инфламмасому.

Введите флуоресцентный краситель для нуклеиновой кислоты, чтобы пометить ядро. Под флуоресцентным микроскопом клетки демонстрируют конденсированные ядра, что указывает на пироптоз, и очаги адапторных белков, указывающие н