Анализ высвобождения лактатдегидрогеназы для выявления гибели макрофагов после воздействия нигерицина

Возьмите аналитическую пластину, содержащую макрофаги, заквашенные липополисахаридом.

Прайминг увеличивает экспрессию неактивных предшественников провоспалительных цитокинов и белков NLRP3.

Добавьте нигерицин, ионофор калия, способствующий оттоку ионов. Это нарушает внутриклеточный уровень калия, запуская белки NLRP3 с образованием большого комплекса.

Олигомеризованный NLRP3 рекрутирует адапторные белки, ASC, вызывая их полимеризацию. Филаменты ASC рекрутируют про-каспазу-1, образуя NLRP3-инфламмасому, мультибелковый комплекс.

Про-каспаза-1 подвергается автоактивации, вызванной близостью, генерируя каспазу-1. Каспазы-1 расщепляют провоспалительный цитокин и белок гасдермин-D, создавая поры плазматической мембраны.

Это приводит к секреции цитокинов и воспалительной запрограммированной гибели клеток, пироптозу, высвобождению внутриклеточного содержимого, включая лактатдегидрогеназу, или ЛДГ. Соберите ЛДГ-содержащую надосадочную жидкость.

Добавьте смесь субстрата — лактат, йодонитретразолий фиолетовый или краситель INT, НАД+ и диафоразу. ЛДГ окисляет лактат до пирувата при одновременном снижении НАД+. Диафораза катализирует восстановление INT, образуя формазан красного цвета.

Интенсивность цвета соответствует высвобождению ЛДГ, при этом повышенные уровни указывают на повышенное повреждение и гибель клеток, связанных с пироптозом.

Для проведения анализа высвобождения ЛДГ в каждую экспериментальную лунку добавляют 50 микролитров среды DMEM-5 с добавлением 10 микромолярного нигерицина, а в лунки для контроля спонтанного и 100% лизиса добавляют 50 микролитров DMEM-5 в течение 60 минут при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе. Через 30 минут добавьте 10 микролитров 10-кратного буфера для лизиса в 100% контрольные лунки для лизиса, а в остальные лунки добавьте 10 микролитров среды. В конце инкубации центрифугируйте планшет, и перелейте по 50 микролитров надосадочной жидкости из каждой лунки в прозрачную пластину с плоским дном.

Далее добавьте в каждую лунку по 50 микролитров свежеразмороженного и подготовленного субстрата для 30-минутной инкубации в темноте, проверяя планшет через 15 минут на предмет подтверждения того, что сигнал не превысит предел обнаружения считывателем планшетов. В конце инкубации добавьте 50 микролитров раствора в каждую лунку и измерьте наружный диаметр₄₉₀ на соответствующем планшетном считывателе, чтобы можно было рассчитать процент лизиса клеток на лунку.