$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Начните с многолуночного планшета, содержащего флуоресцентно меченые нейтрофилы, и обработайте их сывороткой пациента, содержащей антинейтрофильные цитоплазматические антитела.
Эти антитела взаимодействуют с Fc-рецепторами нейтрофилов, активируя сигнальный путь, продуцируя активные формы кислорода или АФК и активируя пептидиларгининдеиминазу.
АФК вызывает дегрануляцию нейтрофилов, высвобождая в цитоплазму ферменты — эластазу и миелопероксидазу. Эти ферменты и активированные пептидиларгининдеиминазы транслоцируются в ядро.
Эластаза расщепляет гистон-H1, а миелопероксидаза модифицирует гистоны, инициируя деконденсацию хроматина. Активированная пептидиларгининдейминаза индуцирует цитруллинирование гистонов, превращая остатки аргинина в цитруллин и способствуя дальнейшей деконденсации.
Деконденсированный хроматин смешивается с внутриклеточными белками, включая антимикробные и цитоплазматические белки. Позже мембрана нейтрофила распадается, высвобождая деконденсированный хроматин, смешанный с цитоплазматическими белками, во внеклеточное пространство, образуя внеклеточную ловушку нейтрофилов (NET).
Добавьте непроницаемый для клеток краситель ДНК, связывающийся исключительно с внеклеточной ДНК в НВЛ. Под флуоресцентным микроскопом нейтрофилы выглядят красными с зелеными внеклеточными паутинчатыми структурами, подтверждающими образование НВЛ.
Изготовьте клеточную суспензию с плотностью 420 000 клеток на миллилитр в фенольной среде без красных РПМИ-1640, содержащей 2% FCS. Добавьте 37 500 нейтрофилов в 90 микролитрах в каждую лунку черного 96-луночного планшета с плоским дном.
Далее добавьте по 10 микролитров выбранного стимула, в трех экземплярах, чтобы достичь концентрации 10% в каждую лунку. Всегда включайте отрицательный контроль в трех экземплярах. Инкубируйте в темноте при температуре 37 градусов Цельсия в течение желаемого времени, от 30 минут до 2, 4 или 6 часов. Затем приготовьте объем непроницаемого красителя ДНК, необходимый для добавления 25 микролитров 5-микромолярного непроницаемого красителя ДНК, чтобы достичь конечной концентрации 1 микромоль в каждой лунке.
За 15 минут до окончания времени инкубации добавьте в каждую лунку по 25 микролитров 5-микромолярного непроницаемого красителя ДНК. Продолжайте инкубацию в течение последних 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия в темноте. После этого очень осторожно извлеките надосадочную жидкость и при необходимости уберите в хранение. Добавьте 100 микролитров 4% параформальдегида. Держите тарелку в темноте, и сразу приступайте к следующему разделу.
После настройки параметров выберите Z Series. Выберите 10 в качестве количества шагов. Выберите 3 микрометра в качестве размера шага. Загрузите планшет в иммунофлуоресцентный конфокальный микроскоп.
Перейдите на вкладку «Запустить». Заполните название и описание тарелки и выберите место хранения. Выберите скважины, которые необходимо приобрести. Выберите время экспозиции для Texas Red и FitC, затем нажмите «Получить пластину» и начните сбор, который займет примерно 1 час на каждую пластину.
После этого выберите Макрос анализа. Затем выберите W1 и выберите пороговое значение. Затем выберите желаемое значение в пикселях, и, наконец, во втором окне ImageJ выберите W2 и выберите пороговое значение с желаемым значением в пикселях. Выберите место назначения файла электронной таблицы. Запустите анализ и сохраните файл журнала.