Выделение липидов из нейтрофилов, полученных из крови человека, путем двухфазного разделения

Возьмите стеклянную пробирку, содержащую гомогенат нейтрофилов с высвобожденными внутриклеточными компонентами.

Добавьте метанол, полярный растворитель, который нарушает липид-липидные и липид-белковые взаимодействия. Присущая метанолу полярность равномерно распределяет полярные липиды, солюбилизируя их. Затем добавьте хлороформ, неполярный органический растворитель, который взаимодействует с неполярными липидами, заставляя их диспергироваться и растворяться.

Центрифуга для отделения белоксодержащей гранулы от надосадочной жидкости, содержащей липиды, полисахариды и клеточный мусор. Переложите надосадочную жидкость в свежую стеклянную пробирку. Добавьте хлороформ и дистиллированную воду. Центрифугируйте образец.

Добавление воды спонтанно образует двухфазную систему, разделяющую биомолекулы в нижнем слоях хлороформа и верхних слоях водно-метанола.

Слой хлороформа содержит растворенные неполярные липиды, в то время как верхний слой содержит нелипидные загрязнители и большее количество полярных липидов. Удалите верхний водно-метанольный слой, не нарушая липидсодержащий слой.

Используйте вакуумный концентратор для удаления растворителя из липидов. Хранить при более низких температурах до дальнейшего использования.

Чтобы выделить липиды из нейтрофилов периферической крови человека, возьмите подготовленные нейтрофилы и поместите их на лед. Пипетируйте нейтрофилы в стеклянную пробирку с винтовой крышкой объемом 15 миллилитров с уплотнением из ПТФЭ и гомогенизируйте их, встряхивая в течение одной минуты. Затем добавьте 2 миллилитра метанола, а через минуту — 1 миллилитр хлороформа. Встряхнув еще одну минуту, вращайте стеклянные трубки при комнатной температуре и 50 оборотах в минуту в течение 30 минут.

Далее гранулируют белковую фракцию, центрифугируя раствор при температуре 7 градусов Цельсия и 1952 раза г в течение 10 минут. Осторожно сцедите надосадочную жидкость в новую 15-миллилитровую стеклянную пробирку с завинчивающейся крышкой, оставив гранулу, содержащую белок. Храните гранулы при температуре минус 20 градусов Цельсия для будущего количественного анализа.

Добавьте 1 миллилитр хлороформа и подождите одну минуту. Затем добавьте 1 миллилитр дважды дистиллированной воды и переверните стеклянную пробирку с завинчивающейся крышкой с образцом на 30 секунд. После центрифугирования образца, как и раньше, удалите и отбросьте верхнюю фазу вплоть до мутного слоя, но не включая его. Высушите образцы в вакуумном концентраторе при температуре 60 градусов Цельсия и храните их при температуре минус 20 градусов Цельсия до тех пор, пока не потребуется.