$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Возьмите двухкамерную инфекционную систему, разделенную проницаемой мембранной вставкой. Нижний отсек содержит адгезивные кератиноциты человека, или клетки кожи.
Добавьте бактериальные патогены в верхнюю камеру, и инкубируйте. Мембрана предотвращает прямой контакт возбудителей с кератиноцитами. Патогены выделяют стрептолизин S или SLS — небольшой токсин, который проникает через мембрану и достигает клеток.
Котранспортер бикарбоната натрия на кератиноцитах опосредует приток ионов бикарбоната и натрия, поддерживая внутриклеточный рН. SLS связывается с котранспортером и нарушает транспорт ионов, что приводит к внутриклеточному осмотическому стрессу.
Индуцированная стрессом нисходящая сигнализация вызывает деградацию ингибитора, связанного с секвестрированным ядерным фактором-каппа B, или NF-κB, что приводит к его активации. Активированный NF-κB транслоцируется в ядро, что приводит к повышению продукции провоспалительных цитокинов.
При внеклеточной секреции цитокины связываются с рецепторами смерти на клетке-хозяине, инициируя некроз. После инкубации соберите надосадочную жидкость культуры, чтобы оценить воздействие бактериального токсина.
Непосредственно перед лечением используйте 1X PBS для промывания клеток. Затем внесите 2 миллилитра свежей питательной среды с фармакологической обработкой или без нее на шестилуночные планшеты или 0,5 миллилитра среды в лунки 24-луночных планшетов. Затем под ламинарным проточным колпаком с помощью стерильных щипцов осторожно поместите стерильную мембранную вставку размером 0,4 микрона в каждую лунку.
Бережное и стерильное обращение с проницаемыми вставками во время подготовки к инфекции имеет решающее значение для предотвращения повреждения или загрязнения мембраны во время этого процесса.
В верхнюю камеру каждой лунки нанесите свежую питательную среду для клеточных культур, согласно инструкции производителя. Затем нанесите соответствующий объем нормализованных бактериальных культур на верхнюю камеру системы проницаемых мембранных вставок и нанесите бактериальную среду в контрольные лунки.
Осторожное добавление бактерий в верхнюю камеру, а также бережная транспортировка инфицированных клеток в инкубатор имеют решающее значение, поскольку важно, чтобы бактерии не загрязнили нижнюю камеру во время экспериментальной установки.
Чтобы оценить секретируемые белки хозяина, используйте стерильные щипцы для осторожного удаления проницаемой мембранной вставки. Затем, не нарушая монослой клеток, соберите среду из нижней камеры в 1,5-миллилитровые пробирки.
Центрифугируйте образцы при температуре 14 000 RCF и 4 градусах Цельсия в течение 10 минут, чтобы измельчить клеточный мусор. Затем удалите все, кроме 50 микролитров надосадочной жидкости, переложите в свежую 1,5-миллилитровую пробирку и храните при температуре минус 20 градусов по Цельсию или используйте немедленно.