Извлечение лизата клетки-хозяина из инфицированных клеток-хозяев, культивируемых в проницаемой мембранной системе

Начните с посева клеток-хозяев млекопитающих в нижний отсек проницаемой мембранной системы.

Добавьте стрептококк — патогенную бактерию, которая, как известно, выделяет стрептолизин S или токсин SLS, в мембранную вставку. Токсин SLS диффундирует через поры мембраны и достигает клетки-хозяина.

Мембранные натрий-бикарбонатные котранспортеры регулируют транспорт ионов, поддерживая клеточный гомеостаз. Токсин связывается с этими котранспортерами, нарушая транспорт ионов и вызывая осмотический стресс в клетках-хозяевах.

Это активирует несколько нисходящих сигнальных каскадов, в том числе p38 MAPK, митоген-активируемый путь протеинкиназы. Активированный p38 MAPK фосфорилирует свои последующие мишени, инициируя клеточный ответ против бактерий.

Далее снимите проницаемую мембранную вставку. Аспирируйте среду над клетками-хозяевами. Добавьте буфер для лизиса, чтобы высвободить клеточное содержимое. Центрифуга для гранулирования клеточного мусора.

Соберите надосадочную жидкость, содержащую растворимые компоненты лизата, и гранулу, содержащую нерастворимые компоненты лизата. Храните образцы для дальнейшего анализа.

Непосредственно перед лечением используйте 1X PBS для промывания клеток. Затем внесите 2 миллилитра свежей питательной среды с фармакологической обработкой или без нее на шестилуночные планшеты или 0,5 миллилитра среды в лунки 24-луночных планшетов. Затем под ламинарным колпаком с помощью стерильных щипцов осторожно поместите в каждую лунку стерильную проницаемую мембранную вставку толщиной 0,4 микрона.

Бережное и стерильное обращение с проницаемыми вставками во время подготовки к инфекции имеет решающее значение для предотвращения повреждения или загрязнения мембраны во время этого процесса.

Нанесите свежую питательную среду для клеточных культур в верхнюю камеру каждой лунки в соответствии с инструкциями производителя. Затем нанесите соответствующий объем нормализованных бактериальных культур на верхнюю камеру системы проницаемых мембранных вставок и нанесите бактериальную среду в контрольные лунки.

Осторожное добавление бактерий в верхнюю камеру, а также бережная транспортировка инфицированных клеток в инкубатор имеют решающее значение, поскольку важно, чтобы бактерии не загрязнили нижнюю камеру во время экспериментальной установки.

С помощью стерильных щипцов осторожно удалите проницаемую мембранную вставку.

Для оценки лизатов клеток-хозяев осторожно аспирируйте среду над монослоем, не нарушая клетки-хозяева. Затем используйте PBS для промывки клеток один раз. Осторожно аспирируйте PBS и немедленно нанесите объем ледяного буфера для лизиса, чтобы достичь, например, концентрацию белка от 0,5 до 1,5 миллиграмма на миллилитр. Затем инкубируйте образцы на льду в течение 15 минут.

Затем с помощью скребка для клеток отсоедините клетки от поверхности пластины каждой лунки и перенесите все содержимое каждой лунки в 1,5-миллилитровую трубку. Затем центрифугируйте образцы при температуре 14 000 RCF и 4 градусах Цельсия в течение 20 минут.

Чтобы оценить содержание растворимых лизатных компонентов, переложите надосадочную жидкость в свежую пробирку и храните при температуре минус 20 градусов Цельсия или используйте немедленно. Для оценки ядерных или других нерастворимых лизатных компонентов оставьте таблетку в резерве и храните при температуре минус 20 градусов Цельсия или используйте немедленно.