Обнаружение прилипания бактерий к клеткам-хозяевам с помощью флуоресцентной визуализации

Возьмите многолуночный планшет, содержащий адгезивный монослой эпителиальных клеток, чувствительный к бактериальной адгезии.

Добавьте различное количество меченных флуоресцентными белками Pseudomonas aeruginosa, патогенной бактерии, чтобы достичь желаемого соотношения бактерий и эпителиальных клеток.

Центрифуга приблизит бактерии к эпителиальным клеткам, способствуя взаимодействию.

Пили IV типа, белковые волокна бактерий, играют ключевую роль, связываясь со специфическими гликолипидами на эпителиальных клетках, опосредуя прилипание бактерий к клеткам-хозяевам.

После инкубации промойте буфером для удаления неприлипших бактерий. Зафиксируйте клетки, чтобы сохранить клеточную структуру.

Добавьте DAPI, флуоресцентный краситель, который прочно связывается с A-T-богатыми участками ДНК, окрашивая ядро. Накройте ячейки буфером, чтобы предотвратить высыхание клеток.

Получение изображений меченых GFP бактерий, прикрепленных к эпителиальным клеткам с ядром, окрашенным DAPI. Перечислите прилипшие бактерии на одной эпителиальной клетке.

Увеличение количества адгезивных бактерий на клетку-хозяина дозозависимым образом позволяет количественно оценить взаимодействие хозяина и патогена.

Для анализа на адгезию бактерий промойте ранее культивированные монослои клеток A549 три раза, добавив по 100 микролитров теплого PBS в каждую лунку, и аккуратно пипетируйте вверх и вниз. Затем откажитесь от PBS. В качестве альтернативы, после добавления PBS, подождите десять секунд, а затем удалите PBS с помощью вакуума.

Чтобы определить кинетику бактериальной ассоциации, наложите на клетки 100 микролитров желаемых концентраций бактериальной суспензии с различной кратностью инфекции. Раскрутите бактерии и инкубируйте инфицированные клетки A549 при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение еще одного часа. Удалите несвязанные бактерии, пять раз промыв монослои теплым PBS, как показано на рисунке.

Далее зафиксируйте ячейки, добавив 100 микролитров 4% формальдегида во все лунки 96-луночной пластины на льду. Через 15 минут трижды промойте пластину PBS, чтобы удалить раствор фиксации, окрашивая ядра 50 нанограммами на миллилитр DAPI в течение 10 минут при комнатной температуре.

После промывки клеток PBS накройте зараженные клетки A549 100 микролитрами PBS, чтобы избежать высыхания, а затем храните пластину при температуре 4 градуса Цельсия до двух дней в темноте или приступайте к визуализации.