Метод визуализации для изучения реакции кальция в клетках, инфицированных бактериями

Возьмем камеру визуализации, содержащую культуру эпителиальных клеток человека, загруженную флуоресцентным индикатором внутриклеточного кальция.

Добавьте питательную среду, содержащую ионы кальция. Введите болезнетворную бактерию шигеллу и инкубируйте.

Система бактериальной секреции проникает в клетку-хозяина и высвобождает инвазионные эффекторы. Инвазия запускает перестройку актина, образуя вокруг бактерий мембранное изъедание.

В месте инвазии активируется фосфолипаза С, или ПЛК, на плазматической мембране, и рецепторы инозитолтрифосфата группируются на эндоплазматическом ретикулуме или ЭР.

PLC гидролизует мембранный фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат до инозитолтрифосфата, или IP3, который накапливается локально из-за плотной актиновой сетки.

IP3 связывается с рецепторами на ER, вызывая высвобождение кальция. Индикаторы кальция связываются с высвобожденными ионами и излучают флуоресценцию, проявляя местную реакцию кальция.

IP3 медленно диффундирует через актин, еще больше истощая уровень кальция в ER и активируя кальциевый канал плазматической мембраны, что приводит к притоку кальция

.

Флуоресценция в клетке указывает на задержку глобального ответа кальция.

Поместите покровное стекло с ячейками Fluo-4 в камеру для визуализации или камеру со стеклянным дном. Используйте ЭМ-буфер для трехкратной промывки образца, чтобы удалить соединения, которые могут возникнуть в результате лизиса клеток. Затем добавьте один миллилитр ЭМ буфера. Поместите камеру на инвертированный предметный столик флуоресцентного микроскопа, нагретый до 33 градусов Цельсия. Выберите поле для микроскопии и настройте параметры сбора данных, включая время экспозиции и биннинг, если это необходимо, для оптимизации флуоресцентного сигнала Fluo-4.

Чтобы добавить бактерии в образец, осторожно удалите 500 микролитров ЭМ-буфера из камеры и добавьте 500 микролитров бактериальной суспензии, чтобы получить итоговый наружный диаметр₆₀₀ 0,05. Немедленно выполните сбор данных или подождите 10 минут, чтобы бактерии осели на клетках. В конце потока сбора данных получите фазово-контрастное изображение выбранного поля, чтобы визуализировать бактерии, контактирующие с клетками, и мембранные взъерошения, связанные с местами бактериальной инвазии.

Повторяйте процедуру сбора данных с интервалами, которые зависят от продолжительности получения изображения, сохранения файлов и выбора нового поля, чтобы охватить весь процесс. В конце процедуры сбора добавляют в образец два микромоляра ионофора кальция иономицина для определения максимальной амплитуды кальциевых сигналов. Получайте изображения каждые 3–5 секунд, пока сигнал не стабилизируется, обычно менее чем на 10 минут.

Затем добавьте хелатор кальция EGTA в конечную концентрацию 10 миллимоляров для определения флуоресцентного сигнала в отсутствие кальция. Получайте изображения каждые 3–5 секунд до стабилизации сигнала, обычно менее чем за 10 минут. Проводите анализ изображений в соответствии с текстовым протоколом.