Анализ иммунных синапсов между Т-клетками человека и SEB-загруженными клетками Раджи с помощью проточной цитометрии с помощью визуализационной проточной цитометрии
JoVE Encyclopedia of Experiments
Иммунология
0 просмотров • 4:28 мин • July 8th, 2025
Возьмем, к примеру, проточные цитометрические пробирки, содержащие незагруженные клетки Raji и энтеротоксин В золотистого стафилококка или SEB-заряженные клетки Raji.
Эти загруженные SEB клетки Raji функционируют как суррогатные антигенпрезентирующие В-клетки, содержащие суперантиген SEB, интегрированный с молекулами MHC класса II.
Инкубировать с пан-лейкоцитами.
Т-клеточные рецепторы, TCR на Т-клетках, связываются с SEB на клетках Raji, которые, наряду с костимулирующими сигналами, устанавливают стабильное межклеточное соединение, иммунный синапс, что приводит к активации Т-клеток.
Это запускает внутриклеточные сигнальные пути, вызывая перестройку актинового цитоскелета с кластеризацией сигнальных молекул и поверхностных рецепторов в синапсе.
После инкубации закрепите клетки, чтобы сохранить их клеточную структуру. Проникайте в клетки для доступа к внутриклеточным мишеням.
Добавьте меченые флуорофорами анти-CD3 антитела, фаллоидин и DAPI, которые связываются с CD3 в комплексе TCR, актиновых филаментах и ДНК соответственно.
С помощью проточного цитометра визуализируйте флуоресцентные сигналы от CD3 и актина, чтобы определить их обогащение в синапсе в присутствии SEB.
Начните с смешивания одного миллилитра свежевзятой периферической крови человека с 30 миллилитрами буфера для лизиса ACK в конической пробирке объемом 50 миллилитров. Через восемь минут при комнатной температуре заполните пробирку PBS для центрифугирования и повторно суспендируйте гранулу в двух миллилитрах питательной среды для 60-минутной инкубации при 37 градусах Цельсия.
В конце инкубации добавьте 5 x 105 клеток Staphylococcus aureus enterotoxin B или SEB, загруженных или выгруженных, в 500 микролитров питательной среды в отдельные пробирки FACS, а затем 650 микролитров пан-лейкоцитов. Уменьшите количество сокультур и повторно суспендируйте гранулы в 150 микролитрах свежей питательной среды для 45-минутной инкубации при температуре 37 градусов Цельсия.
Затем аккуратно переведите клетки на вихри в течение 10 секунд при 100 об/мин, добавляя 1,5 миллилитра 1,5% параформальдегида. Через 10 минут при комнатной температуре прекратите фиксацию одним миллилитром PBS с добавлением 1% BSA, и соберите клетки центрифугированием. Повторно суспендируйте гранулы в 100 микролитрах PBS плюс BSA и 0,1% сапонина, и добавьте образцы клеток в две отдельные лунки 96-луночной U-образной нижней пластины.
Через 15 минут при комнатной температуре центрифугируйте планшет и повторно суспендируйте гранулы в 50 микролитрах PBS плюс BSA и сапонин, содержащие представляющие интерес флуорофор-конъюгированные антитела или соединения, для 30-минутной инкубации в темноте при комнатной температуре. В конце инкубации промойте клетки три раза в 150 микролитрах PBS плюс BSA и сапонин, и повторно суспендируйте гранулы в 60 микролитрах PBS.
Чтобы получить изображение клеток с помощью проточной цитометрии, откройте аналитическое программное обеспечение, проверьте уровень жидкости и нажмите кнопку «Пуск» в меню прибора. Затем нажмите кнопку Load (Загрузить) и загрузите образцы в порт при появлении запроса.
На вкладке Illumination (Освещение) измените мощность возбуждающего лазера на соответствующую нанометровую длину. Затем отрегулируйте стробы для каналов 4 и 11 и отрегулируйте область для канала 1.
Чтобы оценить регулировку стробирования и мощности лазера, переключите меню «Вид» на соответствующий вентиль и отрегулируйте стробы и мощности лазера до тех пор, пока не станут видны ячейки и пары ячеек. Затем на вкладке Получение файла определите имя образца и количество изображений, которые необходимо получить, а также подходящий гейт для окрашивания CD3, а затем нажмите кнопку Получить, чтобы начать сбор.
Обзор
В данной статье описывается метод изучения активации Т-клеток с использованием клеток Raji, нагруженных SEB, в качестве суррогатных антигенпрезентирующих В-клеток. Процесс включает проточную цитометрию для визуализации формирования иммунного синапса и взаимодействия с Т-клеточным рецептором.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Клеточная биология
- Проточная цитометрия
Теоретические сведения
- Клетки Raji могут быть нагружены суперантигенами, такими как SEB.
- Для активации Т-клеток требуются как распознавание антигена, так и костимулирующие сигналы.
- Иммунные синапсы имеют решающее значение для эффективного Т-клеточного ответа.
- Проточная цитометрия позволяет проводить детальный анализ клеточных взаимодействий.
Цель исследования
- Изучить механизмы активации Т-клеток.
- Визуализировать процесс формирования иммунных синапсов.
- Оценить роль SEB в связывании Т-клеточного рецептора.
Используемые методы
- Подготовка клеток Raji с введенным и без введенного SEB.
- Сокультивирование клеток Raji с пан-лейкоцитами.
- Фиксация и пермеабилизация клеток для окрашивания антителами.
- Проточная цитометрия для визуализации динамики TCR и актина.
Основные результаты
- Успешное формирование иммунных синапсов между Т-клетками и клетками Raji, нагруженными SEB.
- Визуализация обогащения синапса CD3 и актином.
- Демонстрация сигнальных путей активации Т-клеток.
- Количественный анализ ответов Т-клеток на SEB.
Выводы
- Клетки Raji, нагруженные SEB, эффективно имитируют антигенпрезентирующие клетки.
- Проточная цитометрия является мощным инструментом для изучения взаимодействий Т-клеток.
- Понимание динамики иммунологического синапса имеет решающее значение для иммунологических исследований.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный метод позволяет проводить количественную оценку формирования иммунного синапса — критического раннего события при активации Т-клеток, что способствует валидации мишеней при поиске иммуномодуляторов. Визуализируя обогащение CD3 и актином с помощью проточной цитометрии с визуализацией, этот подход обеспечивает механистическое снижение рисков при разработке биологических препаратов, воздействующих на сигнальные пути TCR. Данный подход повышает прогностическую достоверность в доклинических моделях иммунного взаимодействия.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное открытие и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверить гипотезы о TCR-зависимой передаче сигналов с помощью прямой визуализации формирования иммунного синапса.
- Научная ценность: Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем подтверждения костимуляционной и антиген-зависимой активации Т-клеток.
- Практическая ценность: Позволяет снизить биологические риски при разработке иммуномодулирующих кандидатов с помощью количественных показателей синапса.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных систем взаимодействия Т-клеток и АПК для последующего скрининга соединений.
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизированных, воспроизводимых показателей формирования синапсов для оптимизации анализа.
- Практическая ценность: Поддержка использования масштабируемой платформы при переходе от хитов к лидам в разработке иммуномодуляторов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Соответствует системам, релевантным для заболеваний, за счет моделирования взаимодействий Т- и B-клеток человека в путях, стимулируемых суперантигенами.
- Научная ценность: Обеспечивает переход от этапа открытия к доклинической валидации посредством количественной оценки динамики иммунного синапса.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем продвижении исследования, связывая раннее взаимодействие с мишенью с функциональными ответами Т-клеток.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум поиска соединений — от скрининга связывания с мишенью до оптимизации ведущих соединений, в частности, для иммуномодуляторов и адъювантов вакцин.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез о взаимодействиях TCR-pMHC и костимулирующих взаимодействиях в контексте иммунной системы человека.
- Скрининг: предоставляет готовые к анализу системы с количественными результатами визуализации для оценки эффектов соединений.
- Аналитика: обеспечивает расчет показателей обогащения CD3 и актина, что позволяет проводить сравнительный анализ различных экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преклиническую преемственность путем моделирования формирования иммунного синапса человека in vitro.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу проточной цитометрии с визуализацией для иммунного профилирования в различных терапевтических областях.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности в процессе активации T-клеток.
- Практическая ценность: Улучшает стандартизацию и воспроизводимость измерений иммунного синапса между различными лабораториями.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет получения ранних функциональных данных об эффективности иммуномодуляторов.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию кандидатов с учетом рисков на основе количественных данных о формировании синапсов.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области иммунологии, протоколов проточной цитометрии и флуоресцентного окрашивания.
- Зависит от наличия доступных систем имиджинг-цитометрии и контролей компенсации для многоцветных панелей.
- Необходима стандартизация подготовки клеток и времени инкубации для воспроизводимого обнаружения синапсов.
- Требуется учет особенностей адаптации при переходе к первичным иммунным клеткам или клеточным линиям, релевантным для конкретных заболеваний.
- Ограничено необходимостью использования жизнеспособных кокультур клеток и оптимальных условий загрузки SEB для получения стабильных результатов.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Супер-Resolution Imaging в естественных клеток-киллеров Иммунологические Synapse на стекло при поддержке Planar липидного бислоя
Похожие видео
0 Просмотры
Эндотелиальных клеток Planar Модель для работы с изображениями иммунологии Synapse Dynamics
Похожие видео
0 Просмотры
Подготовка липидных бислоев, поддерживаемых бисером, для изучения выхода твердых частиц иммунных синапсов Т-клеток
Похожие видео
0 Просмотры
Многоцветный проточной цитометрии Анализ клеточного иммунного ответа на резус-макак
Похожие видео
0 Просмотры
Техника для TIRF микроскопии в реальном времени, одновременная съемка TCR и его ассоциированных сигнальных белков
Похожие видео
0 Просмотры
Формирование иммунологических синапсов между Т-хелперами и антигенпрезентирующими клетками
Похожие видео
0 Просмотры
Использование липидных бислоев, поддерживаемых шариками, для исследования синаптического выхода Т-клеток
Похожие видео
0 Просмотры
Корковая актин расхода в Т-клетках количественно пространственно-временной корреляционной спектроскопии Изображение структурированных данных микроскопии Освещение
Похожие видео
0 Просмотры
Измерение Т-клетки с помощью визуализации аллореактивности проточной цитометрии
Похожие видео
0 Просмотры
Качественный и количественный анализ иммунной синапсов в системе человека с использованием визуализации проточной цитометрии
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026