Визуализация фагоцитоза макрофагов IgG-опсонизированных эритроцитов в реальном времени

Возьмите слайд канала, содержащий макрофаги мыши. Канал соединяется с резервуарами, заполненными средой, поставляя питательные вещества макрофагам.

Замените среды на среды, содержащие флуоресцентно меченные антитела, которые связываются со специфическими поверхностными гликопротеинами, мечая макрофагами.

Возьмем эритроциты человека, эритроциты, с флуоресцентно мечеными клеточными мембранами. Опсонизируйте эритроциты мышиными антителами IgG, которые специфически связываются с гликофорином А.

Добавьте IgG-опсонизированные эритроциты на предметное стекло, содержащее макрофаги. Fc-рецепторы макрофагов связываются с Fc-областью IgG на эритроцитах, что приводит к кластеризации Fc-рецепторов вокруг контактной области и маркировке эритроцитов для фагоцитоза.

Связывание запускает внутриклеточные сигнальные пути и активирует ГТФазы. Активированные ГТФазы стимулируют реорганизацию актина и полимеризацию, образуя тонкие мембранные выступы, называемые филоподиями.

Кроме того, филоподии простираются вокруг эритроцитов, заключая его в развивающуюся фагоцитарную чашечку. Края чашечки сливаются, образуя фагосому, которая интернализует опсонизированные эритроциты для деградации.

С помощью конфокального микроскопа можно получить покадровые изображения отдельных фагоцитарных событий.

Чтобы пометить перитонеальные макрофаги, замените бикарбонатную среду в каждом канальном стекле на полную среду с добавлением HEPES, и наклоните предметное стекло так, чтобы 100 микролитров интересующего вас мышиного макрофагоспецифического антитела с флуоресцентной меткой были добавлены по каплям в отверстие 100-микролитрового канала предметного стекла. Аспирируйте среду, которая поступает в нижестоящий резервуар, и инкубируйте клетки в течение 20 минут во влажной камере при температуре 37 градусов Цельсия в отсутствие углекислого газа.

В то время как клетки брюшины мечатся, аккуратно перемешайте образец от 4 до 2000 эритроцитов и перенесите 400 микролитров клеток в новую 2-миллилитровую микроцентрифужную пробирку в нагретом алюминиевом блоке внутри ламинарного проточного колпака на срок от 5 до 8 минут.

Когда клетки нагреются до 37 градусов по Цельсию, смешайте с клетками 0,4 микролитра подходящего красного флуоресцентного красителя для плазматической мембраны и поместите клетки обратно в тепловой блок. Через 5 минут промойте клетки, добавив 1,6 миллилитра свежей готовой среды с добавлением HEPES, и центрифугуйте. Поверните трубку, чтобы определить гранулу эритроцитов.

С помощью наконечника пипетки объемом от 1 до 1,5 миллилитра осторожно удалите надосадочную жидкость в двух объемах, не нарушая гранулу. Затем смешайте 2000 микролитров свежей полной среды, обогащенной HEPES, с клетками. Центрифугируйте и повторно суспендируйте гранулу в 400 микролитрах среды. Затем пометьте пробирку PMS на предмет окрашивания плазматической мембраны. В конце 20-минутной инкубации мечения перитонеальных клеток промойте предметное стекло 1 миллилитром свежей полной среды, дополненной HEPES.

Чтобы опсонизировать эритроциты, добавьте 1 микролитр мышиного моноклонального антитела IgG2b против человеческого CD235a в пробирку для образца ПМС. Через 8 минут при температуре 37 градусов Цельсия при перемешивании один раз в минуту перенесите 100 микролитров окрашенных плазматической мембраной, IgG-опсонизированных эритроцитов человека в предметное стекло, содержащее перитонеальные макрофаги. Как только эритроциты человека будут добавлены, установите предметное стекло на дисковый конфокальный микроскоп с вращающимся диском и установите сценический инкубатор на 37 градусов Цельсия и немедленно начните визуализацию клеток.