Кальцеиновое ацетоксиметиловое окрашивание для оценки цитотоксичности, опосредованной естественными клетками-киллерами по отношению к раковым клеткам

Для начала возьмите пробирку, содержащую раковые клетки в бессывороточной среде, чтобы свести к минимуму интерференцию сывороточной эстеразы во время анализа. Инкубировать с нефлуоресцентным кальцеиновым красителем AM.

Активные внутриклеточные эстеразы гидролизуют кальцеин AM в мембранонепроницаемый флуоресцентный кальцеиновый краситель, остающийся в цитоплазме.

Пластинчатые окрашенные кальцеином раковые клетки и эффекторные NK-клетки в тестовых лунках, в то время как контрольные лунки содержат только окрашенные кальцеином раковые клетки без NK-клеток.

Активирующие рецепторы клеточной поверхности NK-клеток связываются с активирующими лигандами на раковых клетках, образуя иммунный синапс. Это связывание активирует передачу сигналов NK-клеток, поляризуя цитотоксические гранулы, содержащие перфорины и гранзимы, в сторону синапса для высвобождения.

Перфорины образуют поры мембраны раковых клеток, способствуя клеточному проникновению гранзимов и инициируя апоптоз. Нарушенная целостность мембраны вызывает утечку флуоресцентного кальцеина, снижая флуоресценцию раковых клеток.

Получение флуоресцентных изображений скважин.

Меньшее количество флуоресцентных живых раковых клеток в лунках, содержащих NK-клетки, по сравнению с контрольными лунками, указывает на цитотоксичность, опосредованную NK-клетками по отношению к раковым клеткам.

Чтобы оценить NK-клеточную цитотоксичность с использованием кальциевого AM, после выращивания клеток клеточной линии рака печени человека до 70-80% конфлюенции, как показано, ресуспендировали клетки в 3 миллилитрах бессывороточного DMEM и пометили клетки 1,5 микролитрами 10 миллимолярного раствора кальция AM в течение 30 минут при комнатной температуре. В конце инкубации соберите клетки центрифугированием, и промойте клетки два раза 5 миллилитрами PBS на одну промывку.

Ресуспендируйте клетки в концентрации 1 x 10⁵ клеток на миллилитр питательной среды и добавьте 100 микролитров клеток в каждую лунку 96-луночного планшета в трех размерах на каждую обработку. Затем добавьте 1 x 10⁵ человеческих NK-клеток в 100 микролитров питательной среды в каждую лунку с клетками-мишенями и поместите планшет в инкубатор для клеточных культур на четыре часа.

После окончания инкубации захватите не менее 10 различных полей изображений кальциевых AM-положительных клеток для каждой репликации каждого условия лечения на флуоресцентном микроскопе с 10-кратным увеличением. Затем рассчитайте процент цитотоксичности по формуле.