Измерение миграции естественных клеток-киллеров в ответ на хемотаксические стимулы

Начните с добавления хемоаттрактантов, таких как хемокин, в многолуночный планшет.

Поместите в лунку трансвеллерную проницаемую камеру с соответствующим размером пор. Добавьте в верхнюю камеру суспензию естественных киллеров, или NK-клеток, и инкубируйте.

Несколько молекул хемокинов диффундируют через мембрану и связываются с рецепторами NK-клеток. Это запускает сигнальные пути, которые способствуют изменениям в цитоскелете, что приводит к направленному движению клеток к более высокой концентрации хемоаттрактанта в нижней камере.

После инкубации перенесите фиксированный объем мигрировавших клеток из нижней камеры в сортировку клеток, активируемых флуоресценцией, или пробирку FACS. Добавьте заданное количество флуоресцентных счетных шариков и выполните подсчет клеток на основе FACS.

Используя следующую формулу, определите абсолютное количество мигрировавших NK-клеток в образце.

Точечная диаграмма показывает количество счетных бусин и ячеек, разделенных в виде отдельных областей, на основе их флуоресценции и рассеивающих свойств.

Чтобы измерить миграцию NK-клеток в ответ на хемотаксические стимулы, соберите NK-клетки человека из 70-80% конфлюентной культуры и ресуспендируйте клетки в концентрации 2,5 x^10-6 клеток на миллилитр среды для культур NK-клеток без сыворотки. Затем добавьте 600 микролитров бессывороточной среды, содержащей интересующий хемоаттрактант NK-клеток, на лунку.

И поместите в каждую лунку среды по одной культуральной вставке диаметром 6,5 миллиметра с порами 5 микрометров. Затем добавьте по 100 микролитров NK-клеток в верхний отсек каждого вкладыша и поместите планшет в инкубатор для клеточных культур на четыре часа.

В конце инкубации перенесите весь объем неадгезивных мигрировавших клеток со дна каждой лунки в отдельные 5-миллилитровые пробирки FACS и добавьте в каждую пробирку по 15 микролитров заданного количества шариков подсчета проточной цитометрии. Затем с помощью проточного цитометра оценивают каждый образец клетки в соответствии со стандартными протоколами проточного цитометрического анализа и рассчитывают абсолютное количество мигрировавших NK-клеток по формуле.