Анализ эффероцитоза апоптотических тимоцитов перитонеальными макрофагами

Эффероцитоз – это процесс, при котором фагоцитарные клетки выводят апоптотические клетки.

Для анализа эффероцитоза получают чувствительные к апоптозу тимоциты мышей. Инкубировать с проникающим в клетки красителем CFSE.

Внутриклеточные эстеразы расщепляют CFSE до непроницаемого для клеток флуоресцентного красителя, окрашивая тимоциты. Добавьте термоинактивированную сыворотку, чтобы предотвратить чрезмерное окрашивание.

Поместите окрашенные тимоциты на планшет для культивирования. Добавьте ставроспорин, ингибитор протеинкиназы, который нарушает критический клеточный сигнальный каскад, индуцируя апоптоз. Кроме того, остатки фосфатидилсерина перемещаются к внешнему листку клеточной мембраны, функционируя как «сигналы к поеданию».

Добавляйте увеличивающие концентрации апоптотических тимоцитов в лунки с несколькими лунками, содержащими активированные перитонеальные макрофаги мыши, которые экспрессируют специфические рецепторные тирозинкиназы.

Эти киназы связываются с экспонированным фосфатидилсерином на апоптотических тимоцитах, облегчая их интернализацию макрофагами.

После инкубации удалите свободно плавающие апоптотические тимоциты. Добавьте меченые флуорофорами антитела к CD11b, которые связываются с молекулами макрофагов CD11b.

С помощью флуоресцентного микроскопа наблюдайте флуоресцентные апоптотические тимоциты в разных флуоресцентных макрофагах, что указывает на эффероцитоз.

Лунки с более высокими концентрациями апоптотических тимоцитов демонстрируют повышенное количество интернализованных тимоцитов.

Для забора тимоцитов после вскрытия грудной полости наивной мыши C57/Black-6 используйте изогнутые щипцы с тонким кончиком, чтобы вытащить тимус. Поместите орган в чашку для культуры тканей, содержащую 10 миллилитров среды RPMI-1640. Измельчите весь тимус на матовых концах 2 предметных стекол микроскопа, и отфильтруйте полученную тканевую суспензию через 70-микрометровое клеточное ситечко в 50-миллилитровую пробирку. Соберите тимоциты центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в 40 миллилитров.

После подсчета снова центрифугируйте клетки и ресуспендируйте до 2 х 10⁸ клеток в 20 миллилитрах свежего PBS на 50-миллилитровую пробирку. Пометьте клетки 5-микромолярным CFSE в 20 миллилитрах PBS на пробирку. Переверните трубки два-три раза, чтобы перемешать, перед инкубацией тимоцитов не более 2 минут при комнатной температуре, защищенной от света. По окончании инкубации прекратите реакцию с 10 миллилитрами инактивированной теплом лошадиной сыворотки, и соберите клетки центрифугированием.

Ресуспендируйте меченые клетки в 40 миллилитрах свежего PBS для подсчета и центрифугирования с последующей дополнительной промывкой 40 миллилитров среды. После промывки средой ресуспендируйте тимоциты в соотношении 7 x 10⁶ клеток на миллилитр среды для тканевой культуры и засейте клетки в 100-миллиметровую чашку для культуры тканей. Затем добавьте в культуру клеток ставроспорин в конечной концентрации 1 микромоль и поместите планшет в инкубатор для культуры тканей на 4 часа.

Для выделения перитонеальных макрофагов введите двум мышам C57/Black-6 внутрибрюшинно 1 миллилитр 3% состаренного тиогликолата в 0-й день, прежде чем вскрыть кожу живота, не нарушая брюшину, на 5-й день.

Чтобы промыть брюшную полость, используйте 10-миллилитровый шприц, оснащенный иглой 18-го калибра, чтобы быстро протолкнуть 10 миллилитров промывочного буфера в полость, прежде чем медленно отсасывать промывочный буфер для сбора в 50-миллилитровую пробирку. Промойте брюшную полость два раза PBS. Ресуспендирование перитонеальных макрофагов в концентрации 2 умно-10 на шестую клетку на миллилитр питательной среды.

Затем засейте по 500 микролитров макрофагов в каждую лунку 24-луночного планшета и поместите планшет в инкубатор для тканевых культур на 2 часа. В конце инкубации аспирируйте надосадочную жидкость, чтобы удалить плавающие клетки, и добавьте в каждую лунку по 500 микролитров питательной среды для тканей.

Немедленно добавьте от 0 до 12 х 10⁶ тимоцитов в 500 микролитрах среды в каждую лунку культуры и поместите планшет в инкубатор для тканевых культур на 4 часа. В конце инкубации промойте каждую лунку два раза свежим PBS для удаления свободно плавающих апоптотических клеток, а затем однократно промойте с буфером для окрашивания. Затем пометьте макрофаги, связанные с планшетами, 200 микролитрами окрашивающего буфера, дополненного соответствующим антителом против CD11b на лунку, и поместите планшет при температуре 4 градуса Цельсия на 20 минут.