Анализ бактериальной внеклеточной белково-опосредованной цитотоксичности на ПМН

Возьмем культуру золотистого стафилококка, патогенной бактерии, которая выделяет лейкоцидин — порообразующий токсин — состоящий из мономерных компонентов S и F.

Гранулируйте клетки и последовательно разбавляйте надосадочную жидкость. Перенесите лейкоцидин-содержащий надосадочный слой в микропланшет, содержащий полиморфноядерные лейкоциты, или ПМН, и инкубируйте.

S-компонент связывается со специфическими трансмембранными рецепторами на PMNs, после чего происходит гетероолигомеризация с F-компонентом для встраивания в клеточную мембрану, что приводит к образованию пор.

Пора вызывает уменьшение внутриклеточных ионов калия, активируя пириновый домен семейства NLR 3 или белок NLRP3.

NLRP3 связывается с связанным с апоптозом пятнистым белком, содержащим домен рекрутирования каспазы, или ASC, который рекрутирует про-каспазу-1, образуя инфламмасому.

Автопротеолиз преобразует про-каспазу-1 в активную каспазу-1, вызывая гибель клеток.

Сбор ячеек через определенные промежутки времени. Добавьте йодид пропидия или PI, который проникает в мертвые клетки через поврежденные мембраны для связывания ДНК, излучая флуоресценцию.

Используя проточную цитометрию, количественно оцените PI-окрашенные клетк