Анализ бактериальной внеклеточной белково-опосредованной цитотоксичности на ПМН
JoVE Encyclopedia of Experiments
Иммунология
0 просмотров • 3:14 мин • July 8th, 2025
Возьмем культуру золотистого стафилококка, патогенной бактерии, которая выделяет лейкоцидин — порообразующий токсин — состоящий из мономерных компонентов S и F.
Гранулируйте клетки и последовательно разбавляйте надосадочную жидкость. Перенесите лейкоцидин-содержащий надосадочный слой в микропланшет, содержащий полиморфноядерные лейкоциты, или ПМН, и инкубируйте.
S-компонент связывается со специфическими трансмембранными рецепторами на PMNs, после чего происходит гетероолигомеризация с F-компонентом для встраивания в клеточную мембрану, что приводит к образованию пор.
Пора вызывает уменьшение внутриклеточных ионов калия, активируя пириновый домен семейства NLR 3 или белок NLRP3.
NLRP3 связывается с связанным с апоптозом пятнистым белком, содержащим домен рекрутирования каспазы, или ASC, который рекрутирует про-каспазу-1, образуя инфламмасому.
Автопротеолиз преобразует про-каспазу-1 в активную каспазу-1, вызывая гибель клеток.
Сбор ячеек через определенные промежутки времени. Добавьте йодид пропидия или PI, который проникает в мертвые клетки через поврежденные мембраны для связывания ДНК, излучая флуоресценцию.
Используя проточную цитометрию, количественно оцените PI-окрашенные клетки, чтобы оценить цитотоксический эффект как концентрации лейкоцидина, так и времени инкубации.
Культивируйте S. aureus в течение ночи в соответствующих средах, используя встряхивающий инкубатор, установленный при температуре 37 градусов Цельсия за день до эксперимента. Субкультура S. aureus путем проведения разведения культур бактерий в течение ночи от 1 до 100 свежими средами. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием до тех пор, пока бактерии не достигнут ранней неподвижной фазы роста. Через пять часов роста переложите 1 миллилитр субкультуры S. aureus в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную пробирку, и центрифугируйте при 5000 г в течение 5 минут при комнатной температуре.
После центрифугирования аспирируйте надосадочную жидкость. Пропустите аспирированные надосадочные жидкости через шприцевой фильтр толщиной 0,22 микрона в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и поместите на лед. Проводят серийные разведения надосадочной жидкости с ледяными средами, используемыми для культивирования золотистого стафилококка. Осторожно добавляйте образцы надосадочной жидкости или только среды для отрицательного и положительного контроля в отдельные лунки 96-луночного планшета, содержащие PMN и лед, как описано ранее.
Аккуратно раскачиваем плиту для распределения надосадочной жидкости и лунок, а также инкубируем при 37 градусах Цельсия. В нужное время достаньте тарелку из инкубатора, и поставьте на лед. Добавьте 300 микролитров ледяного DPBS, содержащего 1 микролитр йодида пропидия, в каждую пробирку проточной цитометрии. Перенесите образцы в пробирки проточной цитометрии на льду. Для положительного контроля добавьте 20 микролитров 10% Triton X в образец перед переносом в пробирку для проточной цитометрии. Анализ окрашивания йодидом пропидия интоксикированных ПМН с помощью проточной цитометрии.
Обзор
В данном исследовании изучаются цитотоксические эффекты лейкоцидина, токсина, вырабатываемого Staphylococcus aureus, на полиморфноядерные лейкоциты (ПЯЛ). Механизм действия заключается в образовании пор в ПЯЛ, что приводит к гибели клеток, которая оценивалась с помощью проточной цитометрии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Клеточная биология
- Токсикология
Теоретическая часть
- Staphylococcus aureus является патогенной бактерией.
- Лейкоцидин — это порообразующий токсин, воздействующий на иммунные клетки.
- Понимание механизма действия лейкоцидина может помочь в разработке терапевтических стратегий.
- Проточная цитометрия используется для количественной оценки гибели клеток.
Цель исследования
- Выяснить механизм цитотоксичности, индуцированной лейкоцидином.
- Оценить влияние концентрации лейкоцидина и времени инкубации на ПМН.
- Использовать проточную цитометрию для количественного определения гибели клеток.
Используемые методы
- Культивирование и разведение Staphylococcus aureus.
- Инкубация ПМН с супернатантом, содержащим лейкоцидин.
- Использование пропидия иодида для окрашивания погибших клеток.
- Проточная цитометрия для анализа жизнеспособности клеток.
Основные результаты
- Лейкоцидин вызывает образование пор в ПМН.
- Гибель клеток коррелирует с концентрацией лейкоцидина.
- Проточная цитометрия эффективно позволяет количественно оценить цитотоксические эффекты.
- Наблюдается активация инфламмасомы NLRP3.
Выводы
- Лейкоцидин из Staphylococcus aureus обладает цитотоксическим действием на ПМН.
- Исследование дает представление о механизме уклонения от иммунного ответа.
- Полученные результаты могут помочь в разработке методов лечения инфекций, вызванных S. aureus.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Количественная оценка цитотоксичности полиморфноядерных лейкоцитов (ПМН) человека, опосредованной бактериальными внеклеточными белками, позволяет снизить механические риски при валидации мишеней для терапии инфекционных заболеваний. Данный анализ обеспечивает прогностическую достоверность при оценке стратегий уклонения патогенов от иммунного ответа, что поддерживает принятие решений на ранних этапах формирования портфеля разработок в области противоинфекционных препаратов. Интеграция показателей цитотоксичности, полученных методом проточной цитометрии, обеспечивает трансляционную преемственность от этапа поиска до выбора доклинических моделей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет исследовать механизмы действия бактериальных токсинов, влияющих на жизнеспособность иммунных клеток.
- Обеспечивает функциональную валидацию белков-мишеней патогенов при изучении взаимодействий между хозяином и патогеном.
- Предоставляет количественные данные для механистического снижения рисков при разработке антивирулентных стратегий.
- Облегчает отбор потенциальных мишеней на основе профилей цитотоксичности.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет создать воспроизводимый количественный анализ цитотоксичности внеклеточных белков.
- Стандартизирует результаты проточной цитометрии для рабочих процессов высокопроизводительного скрининга.
- Обеспечивает надежное сравнение концентраций токсинов и времени инкубации в различных условиях.
- Подготавливает валидированные биологические системы для последующей оценки соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Позволяет сопоставить данные о цитотоксичности in vitro с иммунными ответами клеток, имеющими значение для патогенеза заболевания.
- Обеспечивает преемственность между результатами на этапе поиска и доклиническими моделями инфекции.
- Служит основой для принятия взвешенных с учетом рисков решений о продвижении кандидатов в противоинфекционные препараты, направленных на преодоление механизмов уклонения от иммунного ответа.
- Дает понимание механизмов для разработки трансляционных биомаркеров.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный анализ занимает место в континууме от поиска до доклинических исследований, связывая механизм валидации мишени и выбор трансляционной модели для противоинфекционных программ.
- Биология открытий: Количественная оценка цитотоксичности ПМН для выяснения функций бактериальных белков и путей уклонения от иммунного ответа.
- Скрининг: Обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые результаты проточной цитометрии для сравнительного анализа.
- Аналитика: Предоставляет количественные измерения зависимых переменных для статистической оценки цитотоксических эффектов.
- Трансляционные исследования: Связывает иммунные ответы клеток in vitro с конечными точками в доклинических моделях инфекции.
- Корпоративное повторное использование: Предлагает универсальную платформу анализа для различных бактериальных токсинов и типов иммунных клеток.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней и снижает неопределенность механизмов в исследованиях взаимодействия хозяина и патогена.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость анализа для использования в рамках различных программ.
- Стратегическая ценность: совершенствует процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет возможности ранней оценки биологических рисков.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение противоинфекционных препаратов, направленных на подавление механизмов уклонения от иммунного ответа.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт работы с проточной цитометрией и манипуляциями с иммунными клетками.
- Необходим доступ к валидированному оборудованию и аналитической инфраструктуре.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов анализа и контролей.
- Метод может быть адаптирован под различные бактериальные токсины и популяции иммунных клеток путем оптимизации протокола.
- Результат зависит от наличия высококачественных человеческих PMN и бактериальных супернатантов.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Внедрение системы инфекционного проницаемой мембраны Вставка на основе для изучения влияния секретируемых бактериальными токсинами на млекопитающих клеток-хозяев
Похожие видео
0 Просмотры
Для изучения бактериальный ген регулирование в инфицированных тканях метод, основанный на флуоресцирования
Похожие видео
0 Просмотры
Стандартизированные анализы in vitro для визуализации и количественной оценки взаимодействий между нейтрофилами человека и биопленками золотистого стафилококка
Похожие видео
0 Просмотры
Нейтрофилов внеклеточной Ловушки: Как создать и визуализировать их
Похожие видео
0 Просмотры
Анализ цитотоксичности штаммов Staphylococcus aureus на нейтрофилы после фагоцитоза
Похожие видео
0 Просмотры
Единичных измерений Сотовые вакуолярных разрыв под действием внутриклеточных патогенов
Похожие видео
0 Просмотры
Изоляция Брюшина производные тучных клеток и их функциональные характеристики с Ca2 +-изображений и дегрануляции анализов
Похожие видео
0 Просмотры
Методы для обнаружения цитотоксических Амилоиды следующие инфекции из легочного эндотелиальных клеток, синегнойной палочки
Похожие видео
0 Просмотры
Opsonophagocytic убийства Assay оценить иммунологические реакции против бактериальных патогенов
Похожие видео
0 Просмотры
Количественная оценка цитотоксичности золотистого стафилококка против полиморфонеклеарных лейкоцитов человека
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026