Анализ бактериальной внеклеточной белково-опосредованной цитотоксичности на ПМН

Возьмем культуру золотистого стафилококка, патогенной бактерии, которая выделяет лейкоцидин — порообразующий токсин — состоящий из мономерных компонентов S и F.

Гранулируйте клетки и последовательно разбавляйте надосадочную жидкость. Перенесите лейкоцидин-содержащий надосадочный слой в микропланшет, содержащий полиморфноядерные лейкоциты, или ПМН, и инкубируйте.

S-компонент связывается со специфическими трансмембранными рецепторами на PMNs, после чего происходит гетероолигомеризация с F-компонентом для встраивания в клеточную мембрану, что приводит к образованию пор.

Пора вызывает уменьшение внутриклеточных ионов калия, активируя пириновый домен семейства NLR 3 или белок NLRP3.

NLRP3 связывается с связанным с апоптозом пятнистым белком, содержащим домен рекрутирования каспазы, или ASC, который рекрутирует про-каспазу-1, образуя инфламмасому.

Автопротеолиз преобразует про-каспазу-1 в активную каспазу-1, вызывая гибель клеток.

Сбор ячеек через определенные промежутки времени. Добавьте йодид пропидия или PI, который проникает в мертвые клетки через поврежденные мембраны для связывания ДНК, излучая флуоресценцию.

Используя проточную цитометрию, количественно оцените PI-окрашенные клетки, чтобы оценить цитотоксический эффект как концентрации лейкоцидина, так и времени инкубации.

Культивируйте S. aureus в течение ночи в соответствующих средах, используя встряхивающий инкубатор, установленный при температуре 37 градусов Цельсия за день до эксперимента. Субкультура S. aureus путем проведения разведения культур бактерий в течение ночи от 1 до 100 свежими средами. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием до тех пор, пока бактерии не достигнут ранней неподвижной фазы роста. Через пять часов роста переложите 1 миллилитр субкультуры S. aureus в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную пробирку, и центрифугируйте при 5000 г в течение 5 минут при комнатной температуре.

После центрифугирования аспирируйте надосадочную жидкость. Пропустите аспирированные надосадочные жидкости через шприцевой фильтр толщиной 0,22 микрона в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и поместите на лед. Проводят серийные разведения надосадочной жидкости с ледяными средами, используемыми для культивирования золотистого стафилококка. Осторожно добавляйте образцы надосадочной жидкости или только среды для отрицательного и положительного контроля в отдельные лунки 96-луночного планшета, содержащие PMN и лед, как описано ранее.

Аккуратно раскачиваем плиту для распределения надосадочной жидкости и лунок, а также инкубируем при 37 градусах Цельсия. В нужное время достаньте тарелку из инкубатора, и поставьте на лед. Добавьте 300 микролитров ледяного DPBS, содержащего 1 микролитр йодида пропидия, в каждую пробирку проточной цитометрии. Перенесите образцы в пробирки проточной цитометрии на льду. Для положительного контроля добавьте 20 микролитров 10% Triton X в образец перед переносом в пробирку для проточной цитометрии. Анализ окрашивания йодидом пропидия интоксикированных ПМН с помощью проточной цитометрии.