Анализ цитотоксичности штаммов Staphylococcus aureus на нейтрофилы после фагоцитоза

Принимайте вирулентные и менее вирулентные штаммы золотистого стафилококка.

Добавьте сыворотку, чтобы опсонизировать бактерии.

Перенос возрастающих концентраций бактерий в охлажденные лунки с несколькими лунками, содержащими нейтрофилы. Низкие температуры препятствуют активации нейтрофилов.

Центрифуга для облегчения синхронизированного фагоцитоза.

Нейтрофильные рецепторы связываются с опсонинами, вызывая интернализацию бактерий в фагосомы.

У вирулентных бактерий фагосомная среда вызывает экспрессию цитолитических токсинов.

Эти токсины образуют поры, нарушая фагосомы и нарушая целостность мембраны нейтрофилов.

Тем не менее, менее вирулентные бактерии демонстрируют сниженную экспрессию цитолитических токсинов.

После инкубации отделите нейтрофилы и перенесите их в проточные цитометрические трубки, содержащие флуоресцентный краситель йодида пропидия (PI).

Краситель попадает в нейтрофилы с нарушенными мембранами и окрашивает ДНК.

С помощью проточного цитометра проанализируйте нейтрофилы на окрашивание ПИ.

Зависящее от концентрации увеличение доли PI-положительных нейтрофилов после фагоцитоза вирулентного штамма по сравнению с менее вирулентным штаммом указывает на цитотоксичность вирулентного штамма в отношении нейтрофилов.

Когда субкультивируемый золотистый стафилококк достигнет среднеэкспоненциального роста, перенесите 1 миллилитр культивируемых бактерий в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров и центрифугируйте при 5000 г в течение 5 минут при комнатной температуре. Промойте S. aureus путем аспирации надосадочной жидкости, не нарушая гранулы, и ресуспендируйте гранулированные бактерии в 1 миллилитре DPBS. Сделайте сэмплы вихревыми в течение 30 секунд. Центрифугируйте образцы при 5000 г в течение 5 минут при комнатной температуре.

Чтобы опсонизировать золотистый стафилококк, сначала суспендируйте бактериальную гранулу в 1 миллилитре 20% сыворотки человека. Затем инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия с перемешиванием в течение 15 минут. Промойте опсонизированный золотистый стафилококк после центрифугирования, как показано ранее. Разбавляют опсонизированные штаммы золотистого стафилококка до 1 x 10⁸ колониеобразующих единиц, КОЕ на миллилитр, с помощью ледяного RPMI. Сделайте образец вихрем в течение 30 секунд, и положите на лед.

Подтвердите концентрации золотистого стафилококка, используемые для этих анализов, путем нанесения от 1 до 10 серийных разведений бактерий на агаре. Осторожно добавьте 100 микролитров на лунку каждого штамма золотистого стафилококка, или RPMI, для положительного и отрицательного контроля PMN в 96-луночном планшете на льду, начиная с шага 1.14. Аккуратно раскатайте плиту для распределения золотистого стафилококка по лункам.

Синхронизируйте фагоцитоз, центрифугируя планшет при 500 g в течение восьми минут при 4 градусах Цельсия, и инкубируйте планшет при 37 градусах Цельсия, сразу после центрифугирования как время 0. В нужные моменты времени положите планшет на лед и добавьте 200 микролитров ледяного DPBS, содержащего 1 микролитр йодида пропидия, в каждую пробирку проточной цитометрии, затем перенесите образцы в соответствующую пробирку.