Энциклопедия экспериментов JoVE
Иммунология
0 просмотров • 5:26 мин. • July 8th, 2025
Подвергайте мышь воздействию аэрозольных капель, содержащих Mycobacterium tuberculosis.
Бактерии достигают просвета альвеол — крошечных воздушных мешочков в легких, содержащих макрофаги.
Рецепторы распознавания макрофагальных образов связываются с ассоциированными с патогенами молекулярными паттернами на бактериях, вызывая их поглощение в фагосому.
Поглощенные бактерии выделяют специализированные белки, которые разрывают мембрану фагосомы. Бактерии улетучиваются в цитоплазму и размножаются.
После заражения обезболить мышь. Внутрибрюшинное введение репортерного субстрата бактериального фермента β-лактамазы для флуоресценции репортерного фермента или визуализации REF.
Субстрат через циркуляцию достигает альвеол легких и попадает в инфицированные клетки.
Он проникает через бактериальную внешнюю мембрану, достигая периплазматического пространства, содержащего β-лактамазы.
Подложка содержит β-лактамное кольцо, соединяющее флуорохром и гаситель. Из-за близости флуоресценция флуорохрома поглощается гасителем.
β-лактамазы гидролизуют β-лактамное кольцо, высвобождая флуорофор и приводя к флуоресцентному излучению.
Визуализируйте флуоресценцию для оценки микобактериальной инфекции.
Чтобы продолжить, загрузите животных известного веса в включенную камеру для прививки. В камере могут поместиться до 90 мышей. Затем закройте все защелки на двери. Далее подсоедините небулайзер с помощью стального хомута. Затем нажмите кнопку запуска на камере и установите скорость потока воздуха в диапазоне от 3 до 5 литров в минуту.
Сжатый воздух будет течь со скоростью от 22 до 26 фунтов на квадратный дюйм, и, что важно, должна быть возможность увидеть туман инокулюма в камере. Через 15 минут на передней части панели управления появится красный свет, а звуковой сигнал укажет на окончание пробега. Затем нажмите кнопку сброса, чтобы сбросить таймеры. Чтобы выпустить вакуум, нажмите маленькую красную кнопку на дверце камеры.
Затем откройте дверцу камеры и верните мышей в их домашние клетки. В дальнейшем держите животных в камере содержания. Далее верните банку в транспортировочном контейнере в шкаф биобезопасности. Там слейте оставшуюся бактериальную суспензию в специальный контейнер для отходов. Затем поместите использованную банку из-под небулайзера в пакет для биологически опасных веществ и запечатайте пакет для транспортировки в автоклав.
Чтобы очистить камеру, распылите на внутренние поверхности буферный фенол и 70% этанол. Дайте этим растворам вступить в реакцию на этих поверхностях в течение 10 минут, затем тщательно сотрите их. Выбросьте все салфетки в мусорное ведро. Затем автоклавируйте мусор, контейнер для отходов и использованные банки из-под небулайзера.
Перенесите животных в комнату визуализации. Там делают животное под наркозом в соответствии с текстовым протоколом и вводят ему контрастный субстрат путем внутрибрюшинного введения. В программном обеспечении системы обработки изображений инициализируйте систему и действуйте, когда полоска температуры загорится зеленым цветом. После инициализации системы поместите мышь в камеру визуализации.
Убедитесь, что его ноздри находятся в пределах носового конуса, чтобы он получал анестезию во время визуализации. Теперь вернемся к компьютеру. На панели управления захватом данных выберите флуоресценцию, трансиллюминацию для визуализации всего животного или эпиподсветку для просмотра тканей легких. Для одной мыши установите поле зрения на B, а уровень лампы на высокий.
Для экспозиции используйте автоматическое время, средний биннинг и два или три для F/Stop. Затем установите фильтр возбуждения на 745 нанометров и фильтры излучения на 780 до 840 нанометров. Затем перейдите в раздел «Настройка последовательности» и выберите от 9 до 12 точек трансиллюминации в интересующей вас области. Теперь нажмите кнопку «Получить», чтобы собрать изображения.