Оценка вирулентности Leishmania в культивируемых макрофагах

Начните с многолуночного планшета, содержащего макрофаги, полученные из костного мозга, на покровных листах.

Обработайте макрофаги Leishmania promastigotes — инфекционной стадией паразита.

Во время инкубации паразиты взаимодействуют с макрофагами, способствуя сборке F-актина вокруг места взаимодействия.

Макрофаги поглощают паразитов в фагосомах, окруженных F-актином, образуя паразитофорные вакуоли или ПВ — репликативную нишу.

В ВП паразиты выделяют факторы выживания, увеличивая накопление F-актина вокруг вакуолей и ингибируя их слияние с лизосомами.

Кроме того, паразиты активируют выработку гепсидина — гормона макрофагального пептида, ингибирующего высвобождение железа и повышающего внутриклеточный уровень железа.

Приток железа в вакуоли способствует дифференцировке промастиготы в патогенные амастиготы и способствует их размножению, усиливая вирулентность.

После инкубации промойте для удаления свободных паразитов, затем закрепите и пропитайте зараженные макрофаги.

Введите флуоресцентный краситель нуклеиновой кислоты для окрашивания ядер инфицированных макрофагов и амастигот.

Под флуоресцентным микроскопом небольшие ядра, сгруппированные вокруг большого ядра макрофага, подтверждают присутствие внутриклеточных паразитов, демонстрируя вирулентность лейшмании.

На седьмой или восьмой день после культивирования используйте аспирационный наконечник, установленный на вакуумной линии, чтобы перенести четыре стерилизованных автоклавом 12-миллиметровых стеклянных покровных стеклосборника на дно каждой лунки шестилуночного планшета для культивирования без наложения друг на друга. Подготовьте одинаковые пластины для каждого временного момента эксперимента. Далее промойте полученные из костного мозга культуры макрофагов 2 раза свежим PBS 37 градусов Цельсия и пятью миллилитрами PBS без кальция и магния, добавив по одному миллимолярному ЭДТА на каждую пластину.

Через пять минут при температуре 37 градусов Цельсия соберите отделенные клетки в 50-миллилитровую коническую трубку, дважды промыв каждую пластину еще пятью миллилитрами PBS без кальция и магния. После центрифугирования повторно суспендируйте макрофаги в 5-10 мл свежей макрофагальной среды, полученной из костного мозга, на льду. После подсчета разведите клетки до концентрации 5 x 10⁵ на миллилитр в свежей макрофагальной среде, полученной из костного мозга, и добавьте по два миллилитра клеток на лунку в 6-луночный планшет. Затем инкубируйте клетки в течение ночи в инкубаторе для клеточных культур.

Чтобы заразить клетки L. amazonensis, разбавьте паразитарную суспензию до соответствующей экспериментальной кратности инфекции и добавьте от 50 до 100 микролитров паразитов в каждую лунку всех шестилуночных планшетов, включая все временные точки эксперимента. Инкубируйте макрофаги, полученные из костного мозга, в течение соответствующего периода инфекции и соответствующей температуры.

Затем промойте лунки три раза двумя миллилитрами свежего 37 градусов Цельсия PBS без кальция или магния на лунку, и зафиксируйте исходную временную точку образца от 1,5 до 2 мл 2% параформальдегида на 10 минут. Для планшетов, соответствующих более поздним временным точкам, добавьте в каждую лунку по 2 миллилитра свежей макрофагальной среды, полученной из костного мозга, и верните планшеты в соответствующий инкубатор. Затем зафиксируйте и промойте ячейки для каждого оставшегося момента времени, как показано выше, и храните образцы при температуре 4 градуса Цельсия в свежем PBS.

Чтобы окрашивать клетки DAPI, замените надосадочную жидкость 1,5 мл свежего PBS без кальция и магния, дополненного 0,1% неионогенным моющим средством в течение 10 минут при комнатной температуре, после чего последует три 2-миллилитровых промывания PBS без кальция или магния. Далее окрашивайте клетки двумя микрограммами на миллилитр DAPI в 1 миллилитр PBS в течение одного часа при комнатной температуре. После трех стирок поместите покровные стекла клеточной стороной вниз на отдельные предметные стекла микроскопа, на которых установлен имеющийся в продаже реагент для монтажа, предотвращающий выцветание.

Затем, чтобы количественно определить количество инфицированных клеток, используйте объектив флуоресцентного микроскопа со 100-кратным погружением и счетчик Эмануэля, чтобы определить количество более мелких ядер амастигота, сгруппированных вокруг каждого большого ядра макрофага, окрашенного DAPI.