Создание модели инфекции путем микроинъекции органоидов желудка с патогенными бактериями

Под стереомикроскопом наблюдайте за органоидами желудка, трехмерными клеточными структурами, состоящими из дифференцированных клеток желудка, и стволовыми клетками.

Введите микроинъектор с добавлением возбудителя желудочного тракта Helicobacter pylori.

Введите иглу в органоид-мишень и введите бактериальную суспензию.

Наблюдайте за мутным раствором, развивающимся в просвете.

H.pylori использует специфический адгезиновый белок на своей поверхности для связывания с рецептором желудочных клеток, устанавливая стабильное взаимодействие между бактериями и клетками-хозяевами.

Это взаимодействие вызывает удлинение пилуса бактериальной секреции, большой туннельной структуры, которая простирается к мембране клетки-хозяина.

H.pylori использует пилус секреции для введения факторов вирулентности, включая цитотоксические ассоциированные гены А или CagA, в клетку-хозяина.

Попадая внутрь клетки, CagA подвергается фосфорилированию киназой клетки-хозяина.

Фосфорилированный CagA нарушает регуляцию многочисленных внутриклеточных сигнальных каскадов, которые изменяют функции клетки-хозяина, способствуя раковой трансформации.

Соберите зараженные органоиды для дальнейшего анализа.

Чтобы начать микроинъекцию органоидов, соберите бактерии H. pylori и промойте их в базальной среде в соответствии со стандартными протоколами. После измерения оптической плотности для определения количества бактерий разбавьте культуру до 1 х 10⁹ бактерий на миллилитр в базальной среде.

Втяните стеклянный капилляр в две инъекционные иглы с помощью пуллера для микропипеток и храните в чистой чашке Петри. Затем с помощью щипцов сломайте кончик одной инъекционной иглы, чтобы получить отверстие шириной примерно 10 микрометров.

Работая за стереомикроскопом, установите внутри стерильного капюшона, вставьте иглу в держатель для инъекций и закрепите его на микроманипуляторе. Наберите в иглу примерно 10 микролитров бактериального раствора. Затем поместите 4-луночный планшет для культивирования клеток, содержащий органоиды желудка, под стереомикроскоп.

Перемещаясь с помощью микроманипулятора, расположите иглу близко к органоиду. Введите иглу в органоид одним быстрым движением, а затем введите примерно 0,2 микролитра бактериального раствора в центр органоида. Опыт показывает, что примерно 30 самых крупных органоидов в скважине могут быть закачаны за 5 минут. Инкубируйте введенные органоиды в течение желаемого времени в инкубаторе для клеточных культур.

Часто люди, плохо знакомые с этой техникой, испытывают трудности, потому что им трудно эффективно нацеливаться на органоиды. Желудочные органоиды мышей становятся кистозными, и их легче всего атаковать. Таким образом, инъекция органоидов желудка мыши, например, с помощью красителя, может быть хорошей практикой для данной методики.