Оценка внутриклеточного роста мутантов Coxiella в клетках эукариот

Возьмите многолуночный планшет, содержащий адгезивные эпителиальные клетки, и обработайте его мутантами Coxiella, помеченными зеленым флуоресцентным белком, некоторые из которых имеют мутации в гене системы секреции IV типа, или гене T4SS, что имеет решающее значение для репликации.

Репликативные мутанты взаимодействуют с эпителиальными клетками, вызывая поглощение Coxiella, образуя Coxiella-содержащую вакуоль, или CCV, и рекрутируя лизосом-ассоциированный мембранный гликопротеин-1, или LAMP1, в CCV.

Это облегчает секрецию эффекторных белков в цитоплазму клетки через систему секреции IV типа, способствуя репликации бактерий.

Мутанты с мутациями гена T4SS остаются нереплицированными.

После инкубации окрашивайте клетки флуоресцентным красителем, фиксируйте их и пронизывайте клеточную мембрану.

Введение LAMP1-специфичных первичных антител, взаимодействующих с белками LAMP1 на CCV.

Наложен на меченные красным флуорофором вторичные антитела, взаимодействующие с первичными антителами, в то время как краситель Хёхста окрашивает ядра клеток.

Под эпифлуоресцентным микроскопом краснофлуоресцентные вакуоли, содержащие меньше зеленых Coxiella вблизи ядра, указывают на дефектную репликацию мута