Анализ бактериальной инфекции для изучения анаэробных взаимодействий бактерий и клеток-хозяев

Начните с культивирования эндотелиальных клеток.

Замените среду на анаэробную. Инкубировать в анаэробной камере для температурного равновесия.

Добавьте Porphyromonas gingivalis, патогенную анаэробную бактерию, и коротко инкубируйте.

Бактерии обладают белковыми выступами, известными как фимбрии, которые связываются со специфическими молекулами адгезии на эндотелиальных клетках, способствуя адгезии бактерий.

Это связывание запускает внутриклеточные сигнальные каскады, что приводит к перестройке цитоскелета актина и интернализации бактерий в фагосомы.

После инкубации удалите среду. Промойте с анаэробным буфером для удаления неадгезивших внеклеточных бактерий.

Добавьте мягкое моющее средство, чтобы проникнуть в мембраны клеток хозяина и вызвать лизис клеток, высвобождая внутренние и прикрепленные к поверхности бактерии, не вызывая повреждений.

Разбавляют лизатсодержащие бактерии средами и готовят серийные разведения.

Нанесите эти разведения на кровяные агаровые пластины. Инкубируйте в анаэробных условиях, чтобы позволить Porphyromonas gingivalis размножаться и образовывать колонии.

После инкубации подсчитайте колониеобразующие единицы (КОЕ) на каждой пластине, чтобы количественно определить поверхностно прикрепленные и интернализованные бактерии, указывая на взаимодействие бактерий с клетками-хозяевами.

Для культивирования и экспериментов с Porphyromonas gingivalis поддерживается виниловая анаэробная камера с искусственной атмосферой, содержащей 80% азота, 10% водорода и 10% углекислого газа.

Поместите 30 кровяных агаровых пластин, 500 миллилитров PBS и миллилитры фактора роста эндотелия сосудов, или среды VEGF, внутрь анаэробной камеры за 24 часа, чтобы уравновесить реагенты.

Засейте 4 раза по 10 в 5 эндотелиальных клеток пупочной вены человека, или HUVEC, в лунку в шестилуночных планшетах в среде VEGF и оставьте их в инкубаторе для клеточных культур на ночь для прикрепления. Приготовьте культуры Porphyromonas gingivalis в инфузии мозг-сердце или среде BHI, как описано в сопроводительном тексте, и дайте культурам достичь логарифмической фазы, в то время как оптическая плотность культуры на 660 нанометрах колеблется от 0,5 до 0,7.

Перенесите бактерии в 15-миллилитровую пробирку и оберните кусок парапленки вокруг колпачка, чтобы предотвратить аэробное воздействие. Затем центрифугируйте бактерии в 5000 раз больше g в течение 10 минут. Внутри анаэробной камеры промойте гранулированные бактерии с помощью анаэробного PBS и снова уменьшите в 5000 раз g в течение 10 минут. Ресуспендируйте бактерии в среде VEGF.

Чтобы заразить HUVEC Porphyromonas gingivalis, перенесите шестилуночные планшеты из инкубатора в анаэробную камеру. Отсадите среду из тестовых лунок, и трижды промойте анаэробным PBS.

Определите номер клетки из одной репрезентативной лунки методом исключения трипанового синего. Затем добавьте 2 миллилитра на лунку анаэробной среды VEGF и поместите пластины при температуре 37 градусов Цельсия в анаэробный инкубатор на 20 минут для балансировки.

Определите оптическую плотность бактерий и ресуспендируйте их в достаточном объеме среды VEGF для инфицирования клеток при кратности инфекции в соотношении бактерий к клеткам 100 к 1. Добавьте бактериальную суспензию в клетки и инкубируйте в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия на предмет инфекции. Для лизиса клеток в анаэробной камере готовят 1% веса на объемный раствор сапонина в среде BHI и фильтруют через фильтр размером 0,2 мкм.

Чтобы изучить взаимодействие бактерий с клетками хозяина, извлеките шестилуночный планшет из инкубатора и аспирируйте инфекционную среду. Трижды промыть анаэробным PBS. Затем добавьте по 2 миллилитра раствора сапонина в каждую лунку и инкубируйте в течение 15 минут, чтобы обеспечить лизис клеток.

Далее соскребите клетки со дна лунки, и разведите лизат клеток 1 к 1 средой BHI. Затем сделайте серийные разведения от 1 до 100. Пластину 200 микролитров подойдет разведение на кровяных агаровых пластинах. Оберните пластины парапленкой и инкубируйте их в анаэробном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение семи дней, чтобы дать возможность образоваться колонии. Затем, используя световой короб, подсчитайте колониеобразующие единицы, или КОЕ на каждой пластине.