Визуализация интернализованных анаэробных бактерий в эндотелиальных клетках хозяина

Начните с суспензии активно растущих Porphyromonas gingivalis, анаэробных патогенных бактерий.

Добавьте BCECF-AM, нефлуоресцентный, проникающий в клетки краситель.

Активные цитоплазматические эстеразы гидролизуют краситель во флуоресцентную, непроницаемую для клеток форму, окрашивая бактерии.

центрифуга. Ресуспендируйте бактерии в анаэробных средах.

Добавьте меченые бактерии в лунки с многолуночными планшетами, содержащие покровные стекла с прилипшими эндотелиальными клетками человека.

Инкубировать в анаэробной камере.

Бактериальные фимбрии связываются с рецепторами поверхности эндотелиальных клеток, инициируя внутриклеточные сигнальные каскады.

Это приводит к перестройке актина и интернализации бактерий в фагосомах.

После инкубации промойте покровные стекла с буфером для удаления невнутренних бактерий.

Закрепите клетки с помощью параформальдегида, чтобы сохранить клеточные структуры. Проникните в клетки неионогенным детергентом для доступа к внутриклеточным мишеням.

Добавьте флуоресцентно меченный фаллоидин, который связывается с актиновыми филаментами.

Поместите покровное стекло на монтажный материал, содержащий DAPI, который окрашивает ДНК.

Наблюдайте за флуоресцентными Porphyromonas gingivalis в эндотелиальных клетках с флуоресцентным актином, подтверждающим интернализацию бактерий.

Чтобы визуализировать интернализованные бактерии, сначала асептически перенесите покровные стекла из автоклавного стекла внутрь каждой лунки 12-луночного планшета. Выложите пять раз по 10 до четырех HUVEC на лунку на покровном стекле и инкубируйте в течение 24 часов. Для маркировки бактерий центрифугируйте бактерии в середине логарифмической фазы и ресуспендируйте гранулу с помощью анаэробного PBS. Снова центрифугируйте и повторите этап промывки.

Добавьте 20 микролитров 0,2 миллимоляра BCECF-AM к двум миллилитрам анаэробного PBS, содержащего от пяти до семи умножить на 10 до восьмой бактерии на миллилитр. Выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут в темноте.

Флуоресцентный краситель, который мы используем, может окрашивать большинство анаэробных бактерий. Таким образом, никаких других реагентов, таких как специфическое антитело, не требуется.

Центрифугируйте бактериальную суспензию в 5000 раз больше g в течение 10 минут, чтобы удалить несвязанный реагент для мечения, и повторно суспендируйте бактерии в среде VEGF. Затем заразите клетки HUVEC в соотношении 100 к 1, бактерии к клеткам и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. После инкубации удалите зараженную среду, и трижды промойте клетки PBS. Затем добавьте 4% параформальдегида, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут, чтобы зафиксировать клетки в анаэробной камере.

Извлеките неподвижные элементы из камеры, а затем трижды промойте покровные стекла PBS. Инкубируйте покровные стекла в одном миллилитре 0,2% Triton X-100 в течение 10 минут для проникновения клеток. Затем промойте покровные листы PBS три раза. Теперь добавьте 50 микролитров 50 микрограммов на миллилитр фаллоидина TRITC в каждую покровную крышку и инкубируйте в течение 45 минут при комнатной температуре, чтобы окрасить клеточный олигомерный актин.

После инкубации промойте покровный лист PBS три раза. Переверните покровное стекло на предметном стекле с мягко фиксируемым монтажным материалом, содержащим один микрограмм на миллилитр DAPI для ядерного окрашивания. Затем запечатайте периферию покровного листа лаком для ногтей, и понаблюдайте под конфокальной микроскопией.