Оценка киллерной активности опсонофагоцитов в отношении бактериальных патогенов

Начните с многолуночного планшета, содержащего суспензию Streptococcus pneumoniae.

Введение антител, нацеленных на бактериальные поверхностные антигены, которые взаимодействуют с бактериальными поверхностными антигенами. Это покрывает бактерии антителами, образуя опсонизированные бактерии для иммунного распознавания.

Засейте лунки нейтрофилами, полученными из лимфоцитов периферической крови человека, с добавлением сыворотки кролика, содержащей белки комплемента.

Во время инкубации белки комплемента, такие как C3b, откладываются на поверхности бактерии, что приводит к дополнительному покрытию опсонином бактерий, что усиливает распознавание бактерий нейтрофилами.

Специфические поверхностные рецепторы на нейтрофилах взаимодействуют с опсонинами на бактериях, способствуя бактериальному поглощению через фагоцитоз.

Внутри фагосомы нейтрофилы разрушают поглощенные бактерии, уменьшая количество бактерий в буфере.

После инкубации нанесите разбавленный раствор для совместной культуры на кровяную агаровую пластину, чтобы отдельные бактерии могли образовать колонии.

Сравните количество колоний в бактериях, обработанных опсонином, и в необработанных бактериях.

Меньшее количество колоний при лечении опсонином указывает на более высокое уничтожение бактерий, что предполагает успешное уничтожение опсонофагоготов.

Разморозьте одну пробирку бактериального запаса. Гранулируйте бактерии в 6000 раз больше g в течение двух минут и ресуспендируйте клеточную гранулу в OBB в оптимальном разведении, полученном на предыдущем этапе. Пипеткой 10 мкл ресуспендированного бактериального разведения на лунку в 96-луночный планшет для культивирования клеток с круглым дном. Затем добавьте по 20 микролитров соответствующего антитела или лекарственного препарата в каждую экспериментальную лунку в двух экземплярах.

Для контрольных скважин используйте 1X PBS или OBB, в зависимости от буфера, используемого для обработки скважин. Встряхните планшет с образцом примерно со скоростью 90 об/мин при комнатной температуре в течение одного часа.

Чтобы собрать HL60-дифференцированные клетки, которые обрабатываются DMF за три дня до этого, гранулируйте клетки в 500 раз больше г в течение трех минут. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу не менее чем 10 миллилитрами 1XPBS. Гранулируйте промытые клетки в 500 раз г в течение трех минут. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в ОББ.

Добавьте стерильную неразбавленную сыворотку от маленького кролика в окончательном объеме от одного до пяти. После одночасового бактериального культивирования разделите каждый образец на дублирующие лунки для двух групп. Далее добавьте 50 микролитров смеси дополнения HL60 в каждый экспериментальный набор лунок и 50 микролитров ОББ только в лунки от бактерий. Встряхните 96-луночный планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение часа.

Чтобы покрыть образцы, разбавьте каждую лунку OBB в окончательном объеме от одного до пяти так, чтобы объем каждого образца составлял не менее 50 микролитров. Затем пипеткой впрыскивайте 50 микролитров каждого образца непосредственно на отведенную область бактериальной культуральной пластины, обеспечивая достаточное расстояние между образцами. Накройте крышкой и дайте образцам высохнуть в течение примерно 15 минут при комнатной температуре.

Переверните планшеты и заквашивайте на ночь при температуре 30 градусов Цельсия. В качестве альтернативы, культивируют планшеты в анаэробных банках, чтобы проверить, влияют ли бескислородные условия на рост бактерий или для контроля морфологии. После ночного культивирования подсчитайте колонии в каждой назначенной области отбора проб и приступайте к анализу данных, сравнивая количество живых клеток в каждом наборе с соответствующими контрольными данными.

Наиболее сложными аспектами создания этого метода впервые, вероятно, будут оптимизация исходных КОЕ бактериального фонда, а также обеспечение эффективной дифференцировки клеток HL60.