Оценка интернализованных Porphyromonas gingivalis в эндотелиальных клетках хозяина

Во время инфекции Porphyromonas gingivalis фимбрии на анаэробных бактериях связываются со специфическими рецепторами на клетках хозяина.

Это связывание инициирует внутриклеточные сигнальные каскады, что приводит к перестройке актина и интернализации бактерий в фагосомах.

Чтобы оценить выживаемость интернализованных Porphyromonas gingivalis в эндотелиальных клетках in vitro, возьмите многолуночный планшет, содержащий эндотелиальные клетки, прикрепленные к покровным стеклам.

Добавьте суспензию Porphyromonas gingivalis. Инкубируйте для облегчения усвоения бактерий.

Удалите среду и промойте с помощью анаэробного буфера для удаления невнутренних бактерий.

Добавьте среды, содержащие антибиотики, непроницаемые для эндотелиальных клеток, для уничтожения поверхностно прикрепленных бактерий.

Инкубируйте с мягким поверхностно-активным веществом, чтобы лизировать эндотелиальные клетки, высвобождая бактерии, не вызывая их лизиса.

Разведите собранный лизат с помощью среды. Приготовьте серийные разведения лизата.

Нанесите разведения на кровяные агаровые пластины. Инкубация в анаэробных условиях, чтобы Porphyromonas gingivalis росла и образовывала видимые колонии.

Подсчитайте колонии, чтобы оценить способность Porphyromonas gingivalis проникать в эндотелиальные клетки и выживать в них.

После инфицирования клеток HUVEC трижды промойте клетки анаэробным PBS. Далее добавьте в клетки HUVEC 2 миллилитра среды VEGF, дополненной предварительно оптимизированными концентрациями антибиотиков. Инкубируйте клетки в течение одного часа. Отсадите среду, и добавьте в каждую лунку по 2 миллилитра 1% раствора сапонина в БХИ. Выдерживать в течение 15 минут.

Затем соскребите лизированные клетки, и соберите лизат в центрифужную пробирку. Разбавьте лизат 1 к 1 средой BHI, а затем приготовьте серийные разведения, начиная с 1 до 100. Нанесите 200 микролитров подходящей концентрации на кровяные агаровые пластины. Дайте бактериям расти в течение семи дней в анаэробной камере, а затем подсчитайте колонии.